全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN105950544A

(43)申请公布日2016.09.21

(21)申请号CN201610325906.X

(22)申请日2016.05.17

(71)申请人西北民族大学

地址730000甘肃省兰州市城关区西北新村1号

(72)发明人乔自林马忠仁徐水林王家敏令世鑫冯玉萍

(74)专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司

代理人吕玉博

(51)Int.CI

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

全悬浮培养型Marc-145细胞系的

驯化方法

(57)摘要

本发明提供全悬浮培养型

Marc‑145细胞系的驯化方法，步骤如下：

（1）贴壁培养型Marc‑145细胞的培养；

（2）低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系

的驯化；（3）低血清全悬浮培养型

Marc‑145细胞的驯化；（4）无血清全悬

浮培养型Marc‑145细胞的驯化。应用本

发明的细胞驯化方法能够得到悬浮培养的

Marc‑145细胞，该细胞适应低血清和无血

清全悬浮培养，在7.5L的反应器按无血清

培养密度可达8×10

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：

（1）贴壁培养型Marc-145细胞的培养

选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-

145细胞，待细胞生长致密单层后用含10%新生牛血清的DMEM培养液按1：4比

例分瓶传代，置37℃2/Sub的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为

边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；

（2）低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化

a)将步骤（1）所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞分别用含新生牛血清8%、

5%的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在

37℃5%COSub2/Sub培养，在48-72h内细胞形成致密单层；

b)将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；

c)培养液中新生牛血清降为3%，按b步骤中的方法，传代比例降为5/Sup/ml，

100-130r/min、37℃2/Sub摇床培养；

b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×10Sup6/Sup/ml时，800-1000r/min

离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×10Sup6/Sup/ml时，

800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×10Sup6/Sup/ml

时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h

细胞密度均达2×10Sup6/Sup/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc-145

细胞系；

（4）无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化

a)5/Sup/ml，置100-130r/min、37℃5%COSub2/Sub摇床培养；

b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×10Sup6/Sup/ml时，将细胞悬液直接

稀释至5×10Sup5/Sup/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到

第4代时血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达

3×10Sup6/Sup/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc-145细胞系。

2.应用权利要求1所述的方法得到的全悬浮培养型Marc-145细胞。

3.权利要求2所述的全悬浮培养型Marc-145细胞在