布鲁氏菌天然半抗原抗体琼脂扩散试验征求意见稿.docx

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布鲁氏菌天然半抗原抗体琼脂扩散试验

1范围

本文件规定了琼脂扩散试验方法检测牛、羊血清中布鲁氏菌天然半抗原抗体的程序。

本文件适用于检测布鲁氏菌疫苗免疫背景清晰且虎红平板凝集试验结果为阳性牛、羊血清中的布鲁氏菌天然半抗原抗体。在适当检测时机，其阳性结果可作为动物自然感染且正在向体外排出布鲁氏菌的指征。本文件不适用于无疫区评估和个体动物无布鲁氏菌感染证明。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

NH：天然半抗原（Nativehapten）

DGDT：双向琼脂凝胶扩散试验（DoubleGelDiffusionTest）

5器材

5.1移液器（10μL~100μL）及配套吸头。

5.2密闭湿盒。

5.3恒温培养箱。

6试剂

6.1检测抗原：布鲁氏菌天然半抗原（商品化）。

6.2带有梅花孔的1.0%琼脂糖平板（商品化）。

6.3对照血清。

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6.4阴性对照：疫苗免疫血清。

6.5阳性对照：布鲁氏菌感染血清。

7样品制备

牛、羊血液样品采集与处理按照NY/T541执行，且血清经虎红平板凝集试验检测为阳性。

8检测时机的选择

8.1对于仅在未成年（3月龄~8月龄）免疫一次的牛、羊

一般应在免疫后4个月~6个月开始检测。但对于特殊情况，如对于口服S2疫苗的牛、羊，可提前在免疫后2个月开始检测；对于接种M5系列疫苗的羊，应推后到免疫后6个月开始检测。

8.2对于成年（性成熟）后仅免疫一次的牛、羊

一般应在免疫后6个月~8个月开始检测。但对于特殊情况，如对于口服S2疫苗的牛、羊，可在免疫后4个月开始检测；对于接种M5系列疫苗的羊，应在免疫后8个月开始检测。

8.3对于成年后免疫二次（间隔1年以上）的牛、羊

一般应在最后一次免疫12个月开始检测。但对于特殊情况，如对于口服S2疫苗的牛、羊，可在免疫后6个月开始检测。对于接种M5系列疫苗的羊，应在免疫后18个月开始检测。

8.4对于成年后频繁免疫或每年免疫一次的牛、羊本方法不适用该类反刍动物的检测。

9试验程序

9.1取出琼脂糖平板、检测抗原、对照血清和待检血清，恢复至室温。将琼脂糖平板快速在酒精灯火苗上经过4次~5次，总共时间不超过10秒，将琼脂糖梅花孔的底部进行封闭，避免加入的抗原和血清从底部渗漏。

9.2在琼脂糖平板每个梅花形的周围孔中分别加入15μL~20μL的待测血清样品，每孔加入一个待检血清。将15μL~20μL的阴性对照血清和阳性对照血清分别加到琼脂糖平板中一个梅花形周围邻近的2个孔（参见下图NC孔和PC孔）中。每块琼脂糖板只需要各设一孔阴性对照和阳性对照。

9.3将等量的检测抗原加入到琼脂糖平板每个梅花形的中央孔（参见下图A孔）中；

9.4将加好样品的琼脂糖平板盖上平皿盖，放入湿盒中，密闭，在37℃恒温培养箱中室温孵育24h~96h。

9.5结果判定

9.5.1沉淀线观察

琼脂糖平板在恒温箱中孵育24h以上，最长96h后，将平板对着光源，并倾斜一定的角度，观察在抗原孔和血清孔之间是否存在沉淀线。

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9.5.2试验成立条件

阳性对照血清与抗原孔之间出现1条沉淀线，并靠近血清孔一侧（参见下图PC孔）；而阴性对照血清与抗原孔之间不出现沉淀线（参见下图NC孔）。

9.5.3结果判定

9.5.3.1在抗原孔与血清孔之间无沉淀线（参见下图V孔），判定该血清不含天然半抗原沉淀抗体，表明该血清来自接种布鲁氏菌疫苗动物或布鲁氏菌自然感染但处于静默期动物。

9.5.3.2在抗原孔与样品血清孔之间出现1条沉淀线，并靠近血清孔（参见下图I孔），判定该血清含天然半抗原沉淀抗体，表明该血清来自布鲁氏菌感染动物，并在动物体内处于活动期，成年雌性反刍动物可能正在通过阴道或奶向体外排菌。

注：对于成年免疫的反刍动物群，可能存在一定比例动物（一般不超过2.0%），体内疫苗株持续感染，可导致天然半抗原抗体持续存在。对于这些动物，即使在通常的合适时机进行检测，也可能会出现与自然感染布鲁氏菌一样的沉淀

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