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竞赛设计及技术路线

1.研究目的

本课题针对严重影响植物生长的安全因素——软腐害，在前期课题组研究植物生

物防治和保护的基础上，选取南方红豆杉为研究材料，通过对南方红豆杉内生菌

进行分离和纯化，进一步通过拮抗实验，探索其对半夏软腐病菌、白菜软腐病

菌、番茄软腐病菌等植物软腐病菌的抑制效果，以期为半夏等中药材、白菜等农

作物等植物软腐病的生物防治提供优良的菌株材料，从而为植物的绿色、安全、

健康生长提供理论和技术支撑。

2.研究意义

南方红豆杉，作为植物资源库中的一株奇葩，在材质、药用等方面起着非常

重要的作用，鉴于其富产紫杉醇等多种药用活性物质的优点，本课题旨在将南方红

豆杉资源进一步优化利用，深入挖掘其在抗菌性、抗病性等方面的潜在价值。植物

内生菌，作为一种新型微生物资源，目前受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发

现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点，近年来已发现了一些有医用、农

用价值的菌株和化合物。本文主要以南方红豆杉为研究对象，研究其内生菌的多样

性，并从中分离出对植物软腐病菌具有抑制作用的拮抗菌株，以进一步加强南方红

豆杉植株内生菌的菌种研究，深化对植物软腐病的防治作用研究，并为生物防治菌

剂的开发和研制积累理论基础。为深入研究植物软腐病的生物防治机理奠定基础，

为南方红豆杉的资源应用开辟新的途径。

3.实验方案及技术路线

3.1实验方案

3.1.1样品采集

南方红豆杉植株采集时间为2012年5月至8月,采集于浙江省金华市婺城区

南部山区，选取1-3块代表性种植地，采用五点采样法，采集南方红豆杉整个植

株，每点5株，分别采取南方红豆杉的根、茎、叶，存入牛皮纸带，做好记录，立

即带回实验室进行内生菌的分离。

3.1.2样品处理及消毒

3.1.2.1表面消毒

取采集的南方红豆杉植株根、茎、叶,用自来水充分冲洗后，分装在三个平板

上，移至已灭好菌的超净台上，点燃酒精灯，用酒精擦拭手，首先将根用无菌水冲

洗2次，再移至70%乙醇浸泡20S，再用2%次氯酸钠浸泡2min，无菌水冲洗3次。

保留最后两次冲洗液，取最后一次冲洗液适量于NA培养基中，进行涂布，完成后

注明标记。取根的最后第二次冲洗液将茎进行第一次冲洗，最后一次的冲洗液进行

茎的第二次冲洗，依次进行上述操作。

3.1.2.2消毒效果验证

采用2种方法验证样品表面消毒效果：①组织印迹法：将以上消毒后的样

品，贴放于NA培养基表面5min后，将培养皿于30℃培养3-5天，观察微生物生

长情况。②消毒液涂板法：将表面消毒的最后一次冲洗液涂布于NA平板上，于

30℃培养3-5天，观察微生物生长情况。如果有菌生长，表明表面消毒不彻底。两

种检测方法均证明以上样品处理和消毒方法可行。

3.1.3内生菌分离

3.1.3.1内生细菌、放线菌分离：样品表面消毒、晾干后转入加有9mL无菌

水无菌研钵中研磨匀浆，取原液、稀释10倍液和100倍液，然后分别涂于NA/高

氏1号平板上,每个稀释度设3个重复，平板倒置在28℃的培养箱内培养。细菌培

养24h，放线菌培养7-10d。

3.1.3.2内生真菌分离：在无菌操作台上将消毒后的材料用无菌刀切成小

块，茎、根：长度2cm左右，等距离均匀放置于含有链霉素浓度为30mg/L的PDA

平板培养基上(3-4片/皿)，设置3个重复，在28℃的培养箱内倒置培养5-7d。

3.1.4细菌、真菌、放线菌的纯化和保存

挑取平板上不同表面形态的细菌、真菌、放线菌单菌落，分别在NA/PDA/高

氏平板上划线培养、分离、纯化，然后将纯化的菌株转接到相应的试管斜面培养基

于4℃保存。

3.2拮抗菌初筛

拮抗细菌的平板初筛采用滤纸片法和打孔法，拮抗真菌、放线菌采用对峙培

养法。

3.2.1拮抗细菌筛选

①滤纸片法：病原菌接种在牛肉膏蛋白陈琼脂培养基上，28℃培养24h后，

用无菌水制成菌悬液备用。稀释病原菌悬液浓度为104-105cfu/ml的菌液，然后吸

取100μl病原菌液涂NA平板，在涂好的平板上匀称的粘上直径为7mm的滤纸三

片，每片滤纸上点接上10μl的供试菌（浓度约为108cfu/ml），每个处理三个重

复，然后置于28℃的培养箱中培养24h，观察是否有抑菌圈出现，并记录抑菌圈大