04第四讲--多糖的分离纯化方法.ppt

*一、多糖提取分离的基本方法原料→前处理→提取→浓缩→沉淀→脱蛋白→脱色、脱脂→干燥→粗多糖第四讲多糖的提取方法1．前处理根据原料的特点，前处量方法不同，一般包括：（1）非极性溶剂处理：脱脂、脱色对植物根、茎、叶、花、果及种子中的多糖，含脂高的应先脱脂，含色素的需进行脱色，通常采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理达到脱脂或脱色的目的。（也可将该操作放在后面）（2）80%乙醇水溶液处理有些原料中含有较多单糖和低聚糖，对多糖的纯度造成影响。由于单糖和低聚糖可溶于热的80%乙醇溶液中，而多糖则不能溶。故可用80%乙醇水溶液除原料中的单糖和低聚糖。2．提取（1）溶剂种类多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液或氯化钠水溶液作提取溶剂。（2）注意事项①尽量避免在酸性条件下提取，因为酸性条件能引起多糖中糖苷键的断裂。②动物中所含多糖多是酸性多糖，常与蛋白质结合在一起，因此常用碱溶液提取法、中性盐溶液提取法和蛋白酶水解法。③当采用碱溶液提取时，要特别注意前处理，以及温度、pH值的控制。因为碱性溶液中比较容易发生美拉德反应，而美拉德反应一旦发生，所产生的色素极难去除，会对进一步的研究造成无法补救的影响。降低美拉德反应产生程度的方法：通过前处理去除小分子糖、避免pH值处于8-10的范围、避免提取温度处于60-80℃。3．浓缩浓缩操作应在尽量低的温度下进行，并尽量防止提取物与氧气的接触。目的：防止多糖被氧化，保持多糖原有结构及生物活性。(1)沉淀法(2)吸附法将干葡聚糖凝胶G25（或吸水棒）加入抽提液中，两者比例为1：5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收多糖约80%。(3)超滤法?超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的浓缩、分离和纯化。超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为50nm-14μm，用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为1-10nm，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为1nm以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限性：它不能直接得到干粉制剂。超滤技术的关键是膜：膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05mm-1.0mm。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％叠氮化钠NaN3中保存。超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartori