DB21T 2325-2014 猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2325—2014

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法

MethodofRT-PCRforthedetectionoftransmissiblegastroenteritisvirus

2014-07-05发布2014-09-05实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2325—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：于学武、谷志大、赵晓彤、陈瑶、赵凤菊、赵培、闫明媚、兰德松、关乃鹏、关淼、孙世宇、华泽军、刁贺军、王志国

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DB21/T2325—2014

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中TGEV核酸的检测。

本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

兽医实验室生物安全技术管理规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：碱基对（basepair）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：HSTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avianmyeloblastosisvirus）

PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）

4原理

TGEV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

5仪器和器材

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DB21/T2325—2014

本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2~8℃,-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管、0.2mL离心管、微量移液器和吸头。

6试剂和材料

6.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。

6.2氯仿：4℃预冷。

6.3异丙醇：4℃预冷。

6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。

6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121(±2）℃,高压灭菌15min。

6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。

6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。

6.8dNTP（10mmol/L）。

6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：

上游引物F：5′-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3′下游引物R：5′-CAACCCAGACAACTCCATCTA-3′

6.10反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。

6.11反转录引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。

6.12阴性对