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薄层层析的原理与操作

薄层色谱，或称薄层层析(thin-layerchromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以

合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸

如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发

展起来至今，仍被广泛采用。

一、基本原理

薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶

剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤

维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以

吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中

的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，

都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸

引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分

子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而

气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程

是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分

子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不

断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂

沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系

列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍

Rf值)对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需

15～20分钟;混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0.01μg的样

品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显

色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。

二、固定相支持剂的选择和处理

在薄层层析时，对支持剂的选择主要考虑两方面：一是支持剂的性质与适用范围;二是支持剂的颗粒

大小。一般来说，所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应有

不同的吸附能力，即有足够的分辨力;所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。吸附力的强

弱规律可概括如下：吸附力与两相间界面张力的降低成正比，某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂

中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。同族化合物的吸

附程度有一定的变化方向，例如，同系物极性递减，而被非极性表面吸附的能力将递增。

1、支持物的性质与适用范围

薄层层析的支持剂较常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺及DEAE—纤维素。

(1)硅胶

硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂。它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，易制备成不同

类型、孔径、表面积的多孔性硅胶，一般以SiO2•xH2O通式表示。硅胶的吸附活性取决于含水量，吸

附层析一般采用含水量为10%～12%的硅胶，含水量小于1%的活性最高，而大于20%时，吸附活性

最低。用加热脱水法可使硅胶活化，降低吸附活性的硅胶能显著改善分离性能，增加样品的负载量。

硅胶适用于分离酸性和中性物质，碱性物质能与硅胶作用，因此如用中性溶剂展开，碱性物质有时留

在原点不动，或者斑点拖尾，而不能很好地分离。为了使某一类化合物得到满意的分离，可改变硅胶

酸碱性。例如，可用稀酸或稀碱液(0.1～0.5mol/L)或一定pH值的缓冲溶液代替水制备酸性、碱性或

某一pH值的薄层;也可在硅胶中加入氧化铝(碱性)制成薄层;或在展开剂中加入少量的酸或碱进行展

层。

使用硅胶和硅藻土时，通常要先加入粘合剂再在支持板上涂布。常用的粘合剂为煅石膏和