2025届高考生物一轮复习新考案-大单元11生物技术与工程微难点5pcr相关问题分析(人教版2019).docxVIP

微难点5PCR相关问题分析

核心提炼

1．PCR过程模型

图形显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，只有第三轮循环时，才会合成出2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA，即第n轮循环，合成等长的DNA分子数为2n－2n。

2．引物的归类分析

(1)DNA的复制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′－羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合。

①引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。

②细胞内DNA复制以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。

③PCR反应一般以DNA作引物(因为RNA易降解)。

(2)设计引物的主要原则

①引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合。

②引物与靶序列间的Tm(DNA熔解温度)不应过低。

③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。

④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。

⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。

(3)引物的处理

由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环