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玉米品种DNA指纹鉴定技术规程SSR标记法

1范围

本文件确立了玉米品种DNA指纹鉴定技术，规定了仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、参照品种、操作步骤、等阶段的操作指示，以及上述阶段之间的转换条件，描述了SSR标记法数据记录与统计、判定规则等追溯方法。

本文件适用于玉米自交系和单交种的SSR指纹数据采集及品种鉴定，其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

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核心引物coreprimer

品种DNA指纹鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、稳定性好、重复性好等综合特性。[来源：DB45/T1311－2016，3.1]

4原理

由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同玉米品种。

5仪器设备及试剂

见附录A。

6溶液配制

见附录B。

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7引物信息

核心引物名单及序列见附录C。

8操作步骤

8.1样品制备

随机抽取种子、幼苗、叶片等至少20个个体组成的混合样品进行分析或直接对至少5个个体单独进行分析。

8.2DNA提取

8.2.1CTAB提取法

取幼芽或叶片200mg～300mg充分研磨，或取种子充分磨碎，移入2.0mL离心管；每管加入600μL65℃预热的CTAB提取液，混合均匀，65℃保温30min，期间颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置10min；12000g离心5min后，吸取上清液至一新1.5mL离心管，再加入等体积预冷的异丙醇或乙醇，颠倒离心管混匀，在室温放置20min；之后4℃,12000g离心5min，弃上清液；加入70％乙醇或异丙醇，旋转离心管混匀，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀4h以上；加入100μL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

8.2.2SDS提取法

剥取干种子的胚，加入100μL三氯甲烷后研磨，移入1.5mL离心管中，加入300μLSDS提取液，混匀后于12000g离心2min，吸上清液加入预先装有300μL异丙醇和300μL氯化钠溶液的1.5mL离心管中，待DNA成团后挑出，经70％乙醇洗涤后加人200μLTE缓冲液，待充分溶解后备用。

8.2.3试剂盒提取法

使用经验证适合SSR指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。

8.3PCR扩增

8.3.1引物选择

首先选择附录C中前20对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用附录C中后20对引物进行检测；必要时，进一步选择特定标记进行检测。

8.3.2反应体系

各组分的终浓度如下：每种dNTP0.10mmol/L，正向、反向引物各0.15μmol/L，TaqDNA聚合酶0.04U/μL，1×PCR缓冲液（含Mg2+2.5mmol/L)，DNA溶液1.5ng/μL，其余以超纯水补足至10μL。

8.3.3反应程序

95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，55℃~60℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸5min，10℃保存。

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8.4PCR产物检测

8.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测

8.4.1.1凝胶制备

在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，将玻璃板对齐夹紧，在封口处注入琼脂糖溶液，让其在10min～15min凝固密封。然后在烧杯中依次加入5mL5×TBE缓冲液，3.75mL40％PAGE胶，搅拌并用双蒸水定容至25mL；加入200μL过硫酸铵和12μLTEMED，混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50min～60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。

8.4.1.2电泳

去掉封口的琼脂糖胶，将玻璃板固定于重直电泳槽上，向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，小心抽出样品梳。在PCR样品中加入2μL6×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂，混匀，然后向加样孔中点入2μL样品；同时，在一侧样品孔中加入分子量标记。开始电泳，选用的电压梯度为1V/cm～5V/cm，一般电泳300VH~600VH，当指示带（二甲苯青）到达胶板的