仪器分析-高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量.doc

反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量

前言：

本次实验报告在前言中简单阐述HPLC基本原理，介绍HPLC仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。

咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。可乐、APC药片中均含有咖啡因。其分子式为C8H10O2N4，结构式：

一、仪器与试药

高效液相色谱仪（日本岛津）。

咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。

二、方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：C18（4.6x150mm，5μm），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm，柱温30℃，流速：1ml/min，进样量：10μL。

2.2系统适用性实验取供试品20μL进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为4.253min，各峰与相邻峰的分离度为，拖尾因子为，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。对照品及供试品的色谱图如下：

⑴对照品的色谱图

⑵供试品的色谱图

2.3溶液制备

精密称取咖啡因对照品10mg，加甲醇定容至10ml。吸取上述溶液0.5ml，加甲醇稀释到10ml，则溶液浓度为50μg/ml。

供试品溶液：

⑴百事可乐：取30ml的可乐放入烧杯中，用超声波脱气15min，驱赶饮料中的二氧化碳，用移液管精密移取1ml的可乐脱气饮料，用水稀释至10ml。

⑵红牛饮料：用移液管精密移取1ml的红牛饮料，用水稀释至10ml。

⑶取一包叶尔羌红茶，取50ml沸水浸泡1小时，后取该溶液1ml,用水稀释至25ml。

方法学考察

线性范围考察

分别量取贮备液5个以上浓度的样品，置于10ml容量瓶，稀释至刻度，得到对应的浓度系列标准溶液。取上述系列浓度溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤，进样，得系列浓度对应峰面积和保留时间。以标准溶液的质量浓度（X）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其线性方程为：Y=a+BX（请将下图中的线性方程在此写出），相关系数为r=0.9988，表明咖啡因在0.4945-2.4725浓度范围内线性关系良好。

表1标准曲线

编号

1

2

3

4

5

浓度（单位）

4.945

9.89

14.835

19.78

24.725

峰面积

163089

265524

399522

539260

655983

2.4.2加样回收率试验（仅设计实验内容）

精密称量取9份已知含量的同批样品，分为3组，按低、中、高浓度分别加入咖啡因对照品储备液，均定容到一定体积后，进样测定，计算加样回收率。用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在l∶1左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的80%和120%。

表2回收率的实验结果

编号

样品含量

加入量

实测值

回收率

平均回收率

RSD%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

3.样品测定

取分别取样品3份，按照供试品溶液制备方法操作后，HPLC测定，结果平均值为：264031。

测定是峰面积，请代入标准曲线算出样品浓度。

4.讨论

(1)测得样品平均峰面积A=264031，回归曲线y=25471x+26818，r=0.9988，

则得样品浓度C(样)=9.3131μg/ml，即本可乐的咖啡因含量:93.131μg/ml.

(2)标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

(3)高效液相常用的检测器有紫外检测器，荧光检测器，示差折光检测器，我们试验中常常用紫外检测器。

(4)本次试验掌握了高效液相仪的操作，了解了其基本原理。掌握了高效液相测定样品做回归曲线。但是由于时间有限，我们还是不能够很娴熟的操作，相信在以后的锻炼中我们的试验素养会不断提高。