生物催化剂的修饰与改造.ppt

******************************************************第31页,共47页，星期六，2024年，5月4)巯基的化学修饰来源：Cys修饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-X－E-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）E－SH＋?第32页,共47页，星期六，2024年，5月5)二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）第33页,共47页，星期六，2024年，5月氧化：过甲酸:Performicacid第34页,共47页，星期六，2024年，5月6)咪唑基的化学修饰来源：His修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）+?+C2H5OH+CO2?烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH?+HI第35页,共47页，星期六，2024年，5月7）酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第36页,共47页，星期六，2024年，5月8）吲哚基的化学修饰来源：Trp修饰反应：氧化反应修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺2-羟基-5硝基苄溴第37页,共47页，星期六，2024年，5月氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯；2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂第38页,共47页，星期六，2024年，5月但解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。第39页,共47页，星期六，2024年，5月蛋白质化学修饰的局限性化学修饰的专一性是相对的；酶的构象有些改变；化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行。第40页,共47页，星期六，2024年，5月（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。分子间交联、分子内交联（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。第41页,共47页，星期六，2024年，5月二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。（与前面化学修饰区别）第42页,共47页，星期六，2024年，5月酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。第43页,共47页，星期六，2024年，5月应用实例：1）提高酶活力：天冬氨酸酶用胰蛋白酶进行有限水解，从其羧基末端水解切除10多个氨基酸残基，可使天冬氨酸酶的活力提高4-5倍以上。2）消除抗原性：木瓜蛋白酶用氨肽酶进行水解，使其全部肽的2/3被去除，该酶的活力保持不变，而其抗原性却大大降低。第44页,共47页，星期六，2024年，5月（二）氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶