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流感病毒的核酸检测技术操作规范

（一）流感病毒ConventionalonestepRT-PCR检测

应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供

依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。按照

规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快

速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。

1.生物安全要求

实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全

的规定。季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感

病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核

酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操

作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳

区操作。

2.主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）

序号试剂名称货号规格生产商

1One-stepRTPCRkit210212Qiagen

2引物*（20μM)2ODTAKARA

3RNaseinhibitorN2111Promega

注：*引物序列详见表1。

3.设备

（1）BSL-2生物安全柜；

（2）可调转速最大至14000rmp的离心机；

（3）涡旋混合器；

（4）10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；

（5）PCR仪；

（6）电泳槽和电泳仪；

（7）凝胶成像系统。

4.质量控制

（1）实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检

测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。同一试剂不同批

次的灵敏度的检测至少半年一次。

（2）实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴

性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-timePCR检

测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC处理水Real-timePCR检

测Ct值为0。

5.实验步骤

（1）实验注意事项

由于PCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的

措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：

a)核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的

房间中进行。

b)不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉

使用。

c)配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套

进行操作。

d)实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。

e)试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。

（2）设备准备

操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白

剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减

少核酸污染的风险。

（3）试剂准备

注意：配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温

装置中，如预冷的冰盒。

a)引物配制

将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。

用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混

匀，此时引物浓度为100pmol/μL，即100μM。（例如：合成

引物2OD，9.5nmol，则加水量为10×9.5＝95μL），可作为

储存液。将100μM的引物浓度再10倍稀释，配成浓度为

10μM，即可直接用于PCR反应。

b)引物准备

融化引物，振荡所有引物，短暂离心引物，然后放置在

低温装置上。

c)ConventionalRT-PCR试剂

将RT-PCREnzymeMix放置在低温装置上，融化

5×RT-PCRBuffer，颠倒混匀