琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法.ppt

***Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。****（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）.配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。*********关于琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法一实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果（后续实验）检测PCR法鉴定质粒的结果（后续实验）第2页,共20页，星期六，2024年，5月二实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。第3页,共20页，星期六，2024年，5月琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。表1琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小的关系第4页,共20页，星期六，2024年，5月三仪器、材料与试剂1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。3.琼脂糖、1XTAE电泳缓冲液、Goldview、6X载样缓冲液（6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准（Marker）等。第5页,共20页，星期六，2024年，5月1.凝胶电泳系统DYY-6C型?双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)????4-400mA?(1mA)????240W美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell第6页,共20页，星期六，2024年，5月?2.凝胶成像分析系统第7页,共20页，星期六，2024年，5月3.Marker一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。第8页,共20页，星期六，2024年，5月4.常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。5.上样缓冲液第9页,共20页，星期六，2024年，5月4.常用核酸染料名称优点缺点EB（溴化乙锭）染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。Gldview低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,能较好地区分dsDNA与ssDNA。价格稍高，灵敏度较低。背景强烈。SYBR新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。价格昂贵。对小于50bp染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定性差Genefinder花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为470nm。具有安全、灵敏、经济的特点重复性较差。能引起有机体突变。第10页,共20页，星期六，2024年，5月溴化乙锭溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EB），EB染色（