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浅谈PCR技术

学生：柴娟娟学号专业：土壤学

1PCR技术概述

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸

扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能

在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,

使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分

析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术

是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

1.1PCR技术的简史

核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体

外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的

引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合

酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种

合适的条件摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及

延伸的温度与时间。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①

Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下

进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不

均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于

Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一

个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能

引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的

DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新

酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一

种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原

来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性

是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了

扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，

因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA

多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

1.2PCR技术的原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR

由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃

左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便

它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变

性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延

伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模

板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复

循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为

下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几

百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用

Y＝(1＋X)n计算。Y代