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实验二植物病原菌的组织分离

实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化

一、实验目的

通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方

法。

二、材料和用具

玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑

病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，

现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜

封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无

菌滤纸、酒精棉、培养皿

三、分离材料的选择

为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且

最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的

可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

四、植物病原菌的分离方法

病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有

组织分离法和稀释分离法两种。

（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又

分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹

病的分离、甘薯黑斑病）

（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶

等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。期间融化培养基备用。

（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。在操作台内再次消毒

双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿

8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。

（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米

长的病组织。

（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间

长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。

（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂

洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀

放3~4片，使材料与培养基紧密接触。倒置于25—28℃恒温箱内培

养。

（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养

基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是

否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种

病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至

斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。在4℃冰箱中保存。

2、种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）

选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟

后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟，然后取出

小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基

上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培

养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养

3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。

3、病组织内部病原菌的分离（大豆枯萎病菌的分离）

取大豆枯萎病病根沾取70%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在

灯焰灭过菌的解剖刀切去表皮，然后切取其中小块变色的病组织，移

植于培养基表面培养，每皿放3—4块，倒置于25℃温箱中培养2—3

天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4天后，无菌

条件下镜检是否获得纯培养。

（二）.稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子

多的真菌等病原菌的分离，本次实验以白菜软腐病作为材料进行分类

离。

白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮

上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，

再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜

帮下

衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为

伤口上，培养在20—25℃下，经1天左右呈现腐烂，如此反复转种几

次，至病斑纯净为止。

分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成

菌悬液，取灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用

移置环移取菌悬液一环，放在第