测定酶活方法.pdfVIP

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方法

1测定土壤及植物水状况

（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后

的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的

叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦

化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。

（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的

中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。

Notice1RWC计算：RWC=（W－W）／（W－W）×100%

fdtd

2WC计算：WC=（W－W）／W×100%

fdf

W：叶片鲜重；

f

W：叶片干重；

d

W：叶片吸水饱和时的重量。

t

2酶粗提液的制备

为了测定CAT，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含

0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟

15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。

为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含

0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，

离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。

试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。

3酶活性的测定

所有的分光光度分析都使用HitachiU-2000型分光光度计。

3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和

Choudhuri，1985；Zhangetal。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，

13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最

后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照

光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm

处的吸光度作为对照，并将之从A中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原

560

量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个

酶活单位。

Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。

试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓

冲液（pH7.8）

试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8）

3.2CAT与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CAT来说，其活

性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着HO的分解而降低程度来确定（ε