生物化学蛋白质.ppt

K=VM/VR第62页,共72页，星期六，2024年，5月(四)利用选择性吸附的纯化方法1.羟基磷灰石层析羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(简称HA)]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的(PO4)3基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。第63页,共72页，星期六，2024年，5月2.疏水作用层析以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。第64页,共72页，星期六，2024年，5月(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。第65页,共72页，星期六，2024年，5月第66页,共72页，星期六，2024年，5月第67页,共72页，星期六，2024年，5月(六)高效液相层析和快速蛋白液相层析高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。第68页,共72页，星期六，2024年，5月HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。第69页,共72页，星期六，2024年，5月六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定(一)蛋白质含量测定1.凯氏定氮法2.双缩脲法3.酚试剂法4.紫外吸收法5.染料结合法6.胶体金法7.免疫学方法8.生物活性测定法(二)蛋白质纯度鉴定常用电泳法、HPLC法、免疫学方法等第70页,共72页，星期六，2024年，5月基本要求1.掌握蛋白质的酸碱性质。2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。4.掌握蛋白质分离纯化的一般原则。5.熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。6.掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。第71页,共72页，星期六，2024年，5月*感谢大家观看第72页,共72页，星期六，2024年，5月********第30页,共72页，星期六，2024年，5月3.凝胶过滤第31页,共72页，星期六，2024年，5月(二)利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。第32页,共