氨基酸改造麦丹成功实例 .pdfVIP

氨基酸菌种选育关键技术及其成功实例

施巧琴施碧红曾邦定吴松刚

（工业微生物发酵技术国家工程研究中心福建师范大学福州）

吴伟斌黄钦耿黄平翁雪清刘建明

（福建省麦丹生物集团有限公司福州研究院福州）

在我国生物发酵产业中，氨基酸生产占重要地位，除L-谷氨酸、

L-赖氨酸及L-精氨酸等大宗氨基酸产品其生产规模及生产水平均已

达到世界先进水平外，小品种氨基酸诸如：L-苯丙氨酸、L-色氨酸、

L-缬氨酸及L-异亮氨酸等无论在生产规模上，还是在生产水平上，

均与国外有较大的差距。

近年来，笔者福建省麦丹生物集团有限公司及其福州研究院在中

国生物发酵产业协会石维忱理事长的关心和指导下，在国家发展与改

革委员会的立项资助下，充分发挥研发团队的自身技术优势，以构建

高产酸小品种氨基酸工程菌，工业微生物育种新技术及其发酵过程优

化控制为主要技术路线，开展了L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸

及L-异亮氨酸等新菌种选育和新工艺创新的研究与开发，取得了突

破性进展，达到或超过世界先进水平。

一、L－苯丙氨酸

本项目在阐明L-苯丙氨酸代谢途径及其调控机理的前提下，首

先选育酪氨酸缺陷型菌株，然后对代谢途径关键酶aroG及pheA基因

进行串联表达，构建产L-苯丙氨酸工程菌株，该工程菌株在300M3

发酵罐上产酸为45.1g/L。在此基础上，利用基因重组技术、酶分子

定向进化技术对L-苯丙氨酸关键酶基因进行改造，选育出高产工程

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菌株ES-4573-2，该工程菌株在300M发酵罐上产酸为65.2g/L，由

福建省发展和改革委员会组织专家进行技术鉴定，鉴定结论为：该项

目构建的工程菌ES-4573-2其产酸率达国际先进水平，并足以形成具

有自主知识产权的科技成果。

在获得ES-4573-2工程菌株的基础上，从芳香族氨基酸生物合成

的共同途径，分支途径代谢调控网络着手，采用工程菌基因组敲除及

工程菌质粒改造的技术路线，在基因组方面敲除了TrpE、pykA/F、

CsrA基因，在质粒改造方面添加talA及Vhb基因，筛选获得新型菌

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株MF-0018，在300M发酵罐上通过间歇式补料及发酵工艺优化控制，

生产周期48h，产酸达82.2g/L，由中国生物化学与分子生物学学会

工业生物化学与分子生物学分会组织专家进行项目科技成果评审，评

审结论为：项目构建的新型L-苯丙氨酸基因工程菌MF-0018技术路

线及其产酸能力达国际先进水平，能形成自主知识产权。

二、L-色氨酸

本项目在获得L-色氨酸产生菌酪氨酸营养缺陷型菌株基础上，

对L-色氨酸产生菌代谢途径关键酶进行分析，并将关键酶进行克隆

及串联高效表达，构建高效表达的基因工程质粒，结合基因重组技术

及酶分子体外定向进化技术，对L-色氨酸合成相关的关键酶基因以

及工程宿主菌进行修饰和改造，提高关键酶的抗反馈抑制能力及细胞

积累L-色氨酸的能力，最后利用高通量的筛选手段，选育出遗传性

能稳定、具有工业生产价值的高产L-色氨酸工程菌。

在构建L-色氨酸基因工程菌过程中，经30L发酵罐验证试验：

产L-色氨酸水平由T-103的25.3g/L，经T-503的40.6g/L到T-608

的52.6g/L，最终获得高产酸工程菌TK-108，产酸高达65.8g/L，而

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发酵周期仅46h，达国际领先水平。

三、L-缬氨酸

本项目根据L-缬氨酸的生物合成途径，以工业微生物代谢育种手

段，选育以提高L-缬氨酸产量为目的，能解除产生菌正常代谢机制

的突变株，其主要技术路线为：以L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌F-208

为出发菌株，制备原生质体后，经多重物理化学诱变处理，在含α-

氨基丁酸(α-AB)、γ氨基丁酸(γ-AB)结构类似物平板上定向筛

选，获得耐较高浓度的结构类似物的变