水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法.ppt

胆碱酯酶乙酰胆碱脂酶(acetycholinesterase，AchE)水解乙酰胆碱分布于神经元胞质内、神经与肌肉接头处（运动终板）、红细胞等，酶的检测用于追踪神经通路。最适pH7.5~8.0胆碱脂酶(cholinesterase，ChE)水解胆碱的酯见于血清、胰、唾液腺内最适pH8.0~8.5第31页,共45页，星期六，2024年，5月抑制剂毒扁豆碱，DFP（二异丙基氟磷酸）抑制AchE和ChE四异丙基焦磷酸酰胺特异性抑制ChEBW284C51特异性抑制AchE第32页,共45页，星期六，2024年，5月方法：亚铁氰化铜法染色原理作用液碘化乙酰硫代胆碱（底物）5.0mg0.1M顺丁烯二酸缓冲液（pH6）6.5ml0.1M柠檬酸钠0.5ml5M铁氰化钾1.0ml30mM(0.75%)CuSO4（捕捉剂）1.0ml蒸馏水（或抑制剂）1.0ml作用条件温度37℃或室温；时间30～60min用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤。第33页,共45页，星期六，2024年，5月氧化还原酶

oxidoreductases细胞的氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的氧化还原反应是由氢的供体把氢原子转移到氢的受体的酶促反应，即脱氢酶反应第34页,共45页，星期六，2024年，5月脱氢酶脱氢酶是氧化底物，从底物将氢传递给受氢体的酶系。不同于氧化酶，合适的受氢体不是大气中的氧，而是辅酶I、辅酶II（NDAP）或黄素蛋白，然后经氢传递系统，使受氢体还原显色，从而达到定位目的。组化示脱氢酶分不需辅酶和必需辅酶二种。脱氢酶的组化方法，以四唑盐和铁氰化物为受氢体第35页,共45页，星期六，2024年，5月四唑盐法的基本原理受氢体第36页,共45页，星期六，2024年，5月琥珀酸脱氢酶

succinatedehydrogenase，SDH不需辅酶琥珀酸+受氢体＝＝＝延胡索酸+还原的受氢体方法：硝基蓝四唑法Pearson1958最适pH7.6~8.5抑制剂：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制），凡与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。SDH第37页,共45页，星期六，2024年，5月作用液的配制：琥珀酸钠磷酸缓冲液NBT（硝基蓝四唑）*DMSO（二甲亚砜）*NBT先溶于DMSO中，再加入上液第38页,共45页，星期六，2024年，5月步骤：新鲜恒冷箱切片作用液15-35分钟，25℃盐水洗Fca（氯化钙Formalin）固定10分钟80%酒精5分钟甘油明胶封固结果：酶活性表现为蓝紫色沉淀第39页,共45页，星期六，2024年，5月SDH仅位于线粒体中，可作为线粒体的标志酶含SDH活性高的组织为：心肌、肾小管上皮和肝细胞第40页,共45页，星期六，2024年，5月乳酸脱氢酶

lactatedehydrogenase,LDH需辅酶乳酸盐+NAD＝＝＝丙酮酸盐+NADH+H+（辅酶Ⅰ）（还原型辅酶Ⅰ）四唑盐接受还原型辅酶I的氢而被还原为深色不溶的甲沉淀。最适PH7.4方法：LDH四唑盐法LDH第41页,共45页，星期六，2024年，5月LDH是糖原分解的酶系肝、骨骼肌中酶活性强同工酶LDH1为心型，与有氧代谢有关同工酶LDH5为肌型，与厌氧代谢有关，癌组织因糖酵解LDH5增加第42页,共45页，星期六，2024年，5月过氧化物酶见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞的内质网、高尔基体等胞质颗粒中在H2O2存在下氧化各种物质（供氢体）AH2（供氢体）+H2O2──→A（供氢体氧化物）+2H2O显示方法：DAB法过氧化物酶第43页,共45页，星期六，2024年，5月二氨基联苯胺法示过氧化物酶（Graham及Karnovsy,1966）作用液：DAB（二氨基联苯胺）Tris-HCL缓冲液pH7.6新配的0.2%H2O2步骤：1恒冷箱切片或涂片2作用3-30分钟，37℃3蒸馏水洗4光镜直接观察结果:酶活性处棕色。第44页,共45页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第45页,共45页，星期六，2024年，5月************关于水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法