乙酰化修饰定量蛋白质组学-含案例.pptVIP

可以采用Bradford方法及其他方法定量初步定量取各组样本的蛋白质进行SDS电泳，考染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。蛋白质定量乙酰化非标定量详细实验步骤乙酰化非标定量详细实验步骤3：酶切，富集每组样本（各5mg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h12000rpm离心15分钟，弃上清，用lysisbuffer充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1h；加入半胱氨酸封闭试剂1μL,室温处理10分钟；按照酶：蛋白质=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）；收集肽段，纯化，真空冷冻干燥。乙酰化抗体富集RP分离质谱检测乙酰化非标定量详细实验步骤4：除盐，此步操作是将实验过程和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。（1）100%乙腈冲洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上（4）0.1%TFA冲洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脱下样品（6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。乙酰化非标定量详细实验步骤5:RP液相分离或手动RP（1）仪器及试剂：涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）离心机（Thermo，型号：PICO17）RIGOLL-3000高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司）色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，100?（Agela，货号：DC952505-0）乙腈（Merck，货号：100030，德国）氨水（Sigma-Aldrich，货号：17837，美国）流动相A：98%ddH2O，2%乙腈（pH10）-流动相B：98%乙腈，2%ddH2O（pH10）ddH2O用氨水调pH值到10“”“”乙酰化修饰定量蛋白质组学乙酰化修饰非标定量技术简介01乙酰化修饰非标定量技术原理02乙酰化修饰非标定量技术优势03乙酰化修饰实验流程04乙酰化修饰实验结果示例05乙酰化修饰实验详细步骤06经典案例07主要内容蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下，蛋白质的赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一种机制。最近的调查表明，蛋白质的赖氨酸残基的乙酰化普遍存在于人体的代谢酶之中，具有调节代谢通路及代谢酶的活性。乙酰化是一个普遍和重要的蛋白质翻译后修饰，主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面?，还影响参与细胞周期和新陈代谢、肌动蛋白聚合控制，蛋白的乙酰化状态调节受损的癌症和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性，与肿瘤等等疾病密切相关，也是目前正在开发的抗癌药物的靶点。通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现，在生理状况下，存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰，具有广泛的生物学意义。乙酰化修饰非标定量技术简介01赖氨酸发生乙酰化的蛋白对各种生物功能进行调控。实验基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体，对含有乙酰化修饰的赖氨酸肽段进行富集。乙酰化之后的肽段，质量发生42Da的质量变化，基于非标定量的质谱方法对乙酰化肽段进行鉴定。02如：组蛋白乙酰化多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基，将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰基转移酶(histone?acetyltmnsferse，HATs)和组蛋白去乙酰基转移酶(histone?deacetylase，HDACs)共同决定。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，精确地调控基因的转录和表达。技术原理乙酰化修饰非标定量技术原理乙酰化修饰非标定量技术优势乙酰化抗体：特异性识别乙酰化赖氨酸残基；精准锁定目标范围。灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；适用范围广：可以对任何类型的蛋白质乙酰化进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：不受样本数据限制，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；自动化程度高：液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。乙酰化修饰实验流程乙酰化修饰实验流程。1：收集不同组别的样本并分别提