基因工程22ppt课件.pptxVIP

基因工程;（二）DNA直接转移法;DNA直接转移法种类;1.基因枪法;（1）定义

基因枪法（particlegun）又称微弹轰击法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。

它是把遗传物质或其它物质附着于高速微弹上直接射入组织、细胞、细胞器内，完成整合并表达的基因转化方法。

;“GeneGun”Technique;;GJ-1000;基因枪转化率;基因枪法优点：

a)无宿主限制

b)受体类型广泛

c)可控度高

d)操作简便迅速。

正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）；植物基因表达调控研究。;2.多聚物介导转化：

利用多聚物PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等在二价阳离子作用下，促进DNA在原生质体表面形成沉淀，继而通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。

;磷脂介导（Phospholipidsasgene-deliveryvehicles）;脂质溶液;脂质体;3.电穿孔法;;（1）定义：

利用显微注射仪通过机械方法将DNA注入细胞质或核内。;Microinjection;（2）细胞固定（对植物来言）：

琼脂糖包埋法

多聚赖氨酸粘连

吸管支持法

（3）优缺点：

转化率高，10-20%甚至60%

繁琐耗时，需要专门的显微注射仪，

要求精密操作技术和低密度培养技术。;在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

利用花粉管通道将DNA转移至胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎组织。目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。

;农杆菌介导、基因枪法回顾;第三节转化子细胞的筛选;报告基因是指其编码产物能够??快速测定、常用于检测外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织），是否启动表达的一类特殊用途基因。

报告基因与选择基因的区别在于：选择基因往往需要与外界的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选转化细胞；二报告基因的应用不需要外界选择压力的存在。;理想报告基因应具备的条件;目前常用报告基因;1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）;X-gluc5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝（蓝色）

(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸)

4-MUG4-甲基伞形酮（荧光物质）＋β-D-葡萄糖醛酸

（4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）

PNPG对硝基苯酚（溶液呈黄色，PH=7.15，400~420nm）

（4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）

;2、胭脂碱和章鱼碱检测;3、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因;4、荧光素酶（LUC）基因;5、绿色荧光蛋白（GFP）基因;外源基因是否整合到染色体上？

整合方式如何？

整合到染色体上的外源基因是否表达？

基因表达是否产生了完整的蛋白质？

是否产生了目的性状？

需要通过以下鉴定与证实

分子生物学鉴定

表型鉴定

遗传学鉴定;外源基因转化验证内容和技术