任务单元抗原抗体的制备.pptVIP

0102原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。（5）亲和层析法2.核酸抗原的制备”主要步骤01破碎细胞02蛋白质的去除03核酸的沉淀04酚和氯仿05乙醇06核酸的保存温度70℃长期保存20℃4℃（5℃）最佳和最简单介质TE缓冲液（最常用）3.脂多糖抗原的制备4.Ig片段的制备（1）非共价键解离法肽链亚单位之间以氢键、静电引力等非共价键结合，这些键结合力较弱，可经2种方法将其断开制备片段。①改变pH：蛋白质解离的临界值为pH3～4(羧基滴定范围)和pH9～10(赖氨酸—酪氨酸滴定范围)，当加入酸或碱使pH低于，3或高于10时，肽链亚单位就会解离；②利用强变性剂：多数蛋白在8mol／L脲或6moI儿盐酸胍中会发生变性，使肽链亚单位解离，此法也可用于载脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。二硫键是连接免疫球蛋白肽链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和还原法。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不能重新形成二硫键，便于肽链纯化，缺点是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。还原法目前常用，其原理是将二硫键还原成巯基，但还原的琉基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基。0102共价键解离法酶解法酶解法的专一性极好，不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶水解IgG可获得1个Fc段和2个Fab段；胃蛋白酶水解IgG可获得F(ab)：和数个小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作为抗原来制备抗重链血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab)；常作为抗体试剂应用。（四）纯化抗原的鉴定、浓缩与保存1.定量测定生化技术如UV法、双缩脲、酚试剂等蛋白检测方法。常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根据公式计算蛋白含量。蛋白含量(mg／m1)＝A280nm×1.45-A260nm×0.742.纯度鉴定PAGE、免疫电泳、双扩3.免疫活性鉴定免疫电泳、双向免疫扩散法、ELISA4.浓缩与保存任务六抗原抗体的制备主要内容单元一抗原的制备单元二抗血清的制备单元三单克隆抗体的制备单元四基因工程抗体掌握抗血清的制备过程及鉴定方法，正确判定抗血清的质量，能正确处理抗血清制备中的干扰因素。掌握单克隆抗体技术的原理、制备流程和应用。正确理解多克隆抗体、单克隆抗体和佐剂的概念。知晓免疫原的制备方法及意义。了解基因工程抗体的优点、种类和应用。32145学习目标单元一抗原的制备抗原（免疫原）：免疫原（immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten）。抗原颗粒性抗原可溶性抗原蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原颗粒性抗原细胞性抗原：血细胞和组织细胞病原体：细菌、病毒、支原体、寄生虫等一、颗粒性抗原的制备采集静脉血玻璃珠脱纤维离心、洗涤调合适浓度绵羊红细胞的制备作为诊断菌液。01用于制备免疫血清或诊断血清。02用途:(二)细菌抗原的制备01培养细菌02分离、鉴定03扩大培养04合适浓度05灭活处理06离心、洗涤1.制备方法一般性状检定菌种典型；抗原为乳白色悬液；盐水中不自凝。无菌试验甲醛处理后37℃培养2-3d无菌生长纯度检查革兰氏染色镜检10个视野无杂菌。特异性试验玻片凝集试验强阳性。定量凝集试验凝集效价不低于原血清凝集效价的50%浓度测定。1234562.细菌抗原的检定可溶性抗原制备匀浆物中目的抗原提取纯化（不同纯化方法，多次纯化）4分装、保存5组织细胞粗抗原制备组织、细胞清洗和去污处理1细胞裂解（捣碎方法）2匀浆物提取（初筛物）3可溶性抗原制备的一般流程6鉴定（定性、定量、特异性、理化性等）二、可溶性抗原的制备010203040506材料的选取与预处理细胞裂解纯化抗原的提取抗原的鉴定抗原的浓缩与保存五步骤二、可溶性抗原的制备组织：新鲜或低温保存（-40℃）处理方法：器官或组织剪去包膜、结缔组织及大血管，生理盐水或缓冲液洗去残留血液和污物，剪成小块，再捣碎。细胞缓冲液混悬后离心，再进行裂解或