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qRT-PCR流程

摘要：苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质

解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶

活性。

qRT-PCR，是QuantitativeReal-timePCR的简称，也叫实时荧

光定量PCR，是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚

合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待

测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。

qRT-PCR目前已成为不同样本间进行基因表达水平差异比较权威

的方法。然而不适当的实验设计，没有足够的对照和重复，低质量的

RNA样本，逆转录引物选择不理想，qRT-PCR的引物退火温度选择不

当和数据分析方法不正确等都可能会成为影响qRT-PCR检测灵敏度的

因素。

下面普健生物就从8个方面带你详细了解一下qRT-PCR的注意事

项，以提高你的实验成功率。

1、实验设计

由于RNA易降解,对外在环境敏感，因此在实验条件或样本操作等

各个环节都需要严格把控。

2、RNA抽提

RNA的抽提环境非常关键。由于RNA酶无处不在和其难以灭活

的顽固本性，在实验的每一步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有

可能造成RNA酶的污染，从而导致整个实验的失败。因此，严格控制

实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。

RNA抽提建议用专用的操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专

用；所用的耗材、溶液及试剂均应是RNase-free或经过DEPC处理过

的（这一步很费精力但不得不做，所以失败了会很痛苦）；操作过程

中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防手臂上的细菌、真菌

以及人体自身分泌的RNA酶造成污染；避免在操作中说话聊天并且要

记得戴口罩以防RNA酶污染；提取过程应尽量保持低温环境（所以戴

个手套是正确的选择）并减少操作时间。

关于什么是Trizol，某百科是这样说的：

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提

取总RNA。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质

解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶

活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇

等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。为缩短RNA抽提的操作时

间，建议以10-20个样本的小批次来处理样本。无论是Trizol手提

RNA还是使用试剂盒抽提RNA都应包括DNaseI处理步骤以便去除基

因组DNA污染。如果样本在采集后不能立即处理，则需要把样本保存

于-80℃（样本直接冻存或保存于Trizol中）。

3、RNA质量控制

在qRT-PCR中使用高纯度（无污染）和高完整性（无降解）的

RNA是最基本的要求。不纯的RNA样品会抑制PCR反应，产生偏离

的数据。使用部分降解的RNA会产生可变和不正确的定量结果。因此

RNA样品的纯度和完整性是进行下游实验的最基本要求。

如何检测？

RNA样品是否有蛋白污染可以通过OD260/280分光光度法来进

行检测。比值在1.8-2.2之间则表示该RNA质量好，没有蛋白和苯酚

的污染。

RNA的完整性可通过甲醛变性琼脂糖电泳（普通的琼脂糖凝胶电

泳也可）来观察。

↓

▲

高完整性的RNA样品可明显地观察到28S和18S