全血DNA的提取及电泳.pptVIP

全血DNA的提取及电泳晁耐霞一、全血DNA的提取实验原理DNA然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。03最后用乙醇沉淀洗出DNA。04由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。01通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。02用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应。保存于-20℃至-80℃，最好在2个月内提取。每5ml的血液中加入0.4ml0.04MEDTA配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。.材料2.材料与方法3%明胶，TES，Tris饱和酚（pH7.8），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，TE离心机，7ml离心管，1.5mlEP管，中试管，移液器⑵方法：Ⅰ提取WBC取1ml全血等体积3%明胶37℃静置，5·10min取上清3000r/min离心，5min弃上清颠倒混匀溶液颜色均一溶液颜色上下分层沉淀颜色为红色010203040506加入2mlTES加10滴10%SDS轻轻敲击管底震荡混匀颠倒混匀溶液全部变为粉红色溶液颜色变暗Ⅱ破碎WBCⅢ抽提DNA加等体积Tris饱和酚颠倒混匀，50次，3000rpm，离心5min取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色取上清加等体积氯仿：异戊醇（24:1）将上清移入试管颠倒混匀，50次3000rpm，离心5min混匀后溶液变为均一的乳白色上清夜（DNA）蛋白质层酚溶液上清夜（DNA）蛋白质层氯仿溶液Ⅳ沉淀DNA加2.5倍无水乙醇吸出絮状沉淀到1.5mlEP管挥干至无色液体通风橱内放置5min加入100μ?ddH2O溶解缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。无水乙醇与水溶液交界面特点：1.气泡2.白色絮状沉淀AB琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化DNA或者RNA分子的方法。A这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。B1.原理二、琼脂糖凝胶电泳⑶电泳介质琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范围从50nm到大于200nm）决定于琼脂糖的浓度。DNA在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。01DNA带净电荷量的多少与电流强度，电泳缓冲液的pH值和离子强度有关。02⑷.DNA分子的电荷效应：⑸.DNA琼脂糖电泳的分子筛效应：在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小、构型和琼脂糖的浓度是主要的影响因素。①DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。M12345③琼脂糖的浓度示踪染料：有致癌性:EB，吖啶橙等;无毒的染料：goldviewI核酸染料等01.示踪染料和分子量标准参照物02EB03goldview04②分子量标准参照物（Marker）3.实验材料和试剂⑴实验材料：全血基因组总DNA⑵.实验试剂：琼脂糖5×TAE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液（6×loadingdye）：0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃。goldviewI型核酸染料：每10μlDNA加入2μl染料。⑶.实验仪器凝胶成像系统01.制胶1.0%琼脂糖凝胶，0.5×TBE02.上样上样缓冲液03.电泳100V，20min04.观察紫外灯下观察4.操作步骤溶胶上样准备分别吸取上述体积的DNA和6×loadingdye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。DNA:8μl6×loadingdye:2μlTotal:10μl