制剂的基本生产技术病毒增殖技术.pptVIP

第九讲吸附：非特异性静电－特异性受体影响因素：温度、阴、阳离子侵入：病毒直接进入胞浆；细胞吞饮病毒；病毒囊膜与细胞融合包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合，裸露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裂解并释放出核心中的核酸01无囊膜病毒仅有脱壳过程02疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒在吞饮泡内脱去囊膜03主要在胞浆和胞核内完成04脱壳生物合成：细胞浆或细胞核中完成早期：合成酶类、核苷酸原料晚期：合成病毒结构蛋白装配：细胞浆或细胞核中完成核酸、蛋白质盘曲浓缩＋多肽－包壳＋细胞膜的脂质、糖类和病毒蛋白－病毒颗粒释放：细胞通道溢出；细胞死亡自溶释出；细胞膜出芽；细胞膨胀破裂放出掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病毒，对研制高质量生物制品十分重要。二、动物增殖病毒技术大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康经隔离饲养和观察检查证明健康体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大动物的选择：对相应病毒易感，并十分敏感家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬、猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准接种方法01皮内接种：注入表皮与真皮之间，小鼠、大鼠、地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部，猴的结核菌素皮下接种在眼睑部皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿内侧，兔在背部或耳根部肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位02静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉腹腔接种脑内接种三、禽胚增殖病毒技术禽胚的选择SPF鸡胚：无鸡的特定的22种病原体鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体1卵黄囊2卵白3尿囊腔4羊膜腔5气室6壳膜选择10～13日龄的鸡胚，划出气室和胚位1消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚面避开血管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜2用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷造成人工气室3在人工气室孔注入0.1～0.2ml病毒液，轻摇鸡蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上4用石蜡封口，35－37℃培养5选用10～13日龄鸡胚在气室部位距气室分界线3～5mm处打一小孔用细针头斜向蛋壳面插入约5mm，再退出于气室内注射封口后直立，37℃，2h，不翻蛋常规孵化，每日照蛋2次，及时取出死亡胚4℃，12h收获消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明显部位，经研磨制成病毒悬液尿囊腔接种用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒接种：9～11日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎距气室边界上或/和下2～3mm处做标记，消毒后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化收获：4℃放置6h或－20℃0.5～1h，消毒，去除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液和羊水备用卵黄囊接种法5～8日龄鸡胚，在气室中心壳上钻一小孔针头沿胚的纵轴插入约30mm，封口，孵化主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低温保存备用操作在照蛋灯下进行，取10～12日龄鸡胚直立于蛋盘上，划出气室和胚胎位置在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔010302羊膜腔接种法：8～13日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小口，用弯头镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入鸡胚注入病毒液0.01～0.02ml无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用常用于狂犬病毒的增殖脑内接种法接种方法同脑内接种针头刺入胚体内接种胚体接种法111～14日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向2用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见3用注射器顺血流方向刺入血管注入0.0