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免疫组化实验流程

演讲人：

日期：

目录

01

02

03

04

实验准备

样本处理与制片

免疫组化染色

显微镜观察与图像分析

05

06

实验结果解读与报告撰写

免疫组化技术应用领域

01

实验准备

用于分离和清洗抗体等试剂。

离心机

用于保持实验温度稳定，确保实验结果的准确性。

恒温箱

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用于观察免疫组化染色后的组织样本。

显微镜

用于储存试剂和样本，避免其变质或失效。

冰箱

实验室设备准备

试剂与材料准备

特异性抗体

用于与样本中的抗原结合，是免疫组化实验的关键试剂。

抗原修复液

用于修复组织样本中的抗原，提高抗体的结合率。

封闭液

用于封闭组织样本中的非特异性位点，降低背景染色。

荧光标记二抗

用于与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-二抗复合物，从而检测抗原的存在。

实验过程中要注意防止试剂的污染和误用，确保实验的准确性。

实验结束后要及时清理实验台面和仪器设备，避免残留试剂对后续实验产生干扰。

实验人员必须佩戴手套和口罩，避免试剂与皮肤和呼吸道直接接触。

安全防护措施

02

样本处理与制片

样本采集

根据实验目的和抗体特性，选择合适的组织或细胞样本，采集时应尽量保持样本的完整性。

样本固定

将采集的样本立即放入固定液中，避免组织或细胞发生自溶或腐败，常用的固定剂有甲醛、戊二醛等。

样本采集与固定

浸蜡

将透明后的样本浸入熔化的石蜡中，使石蜡逐渐渗入组织内部，起到支撑和固定作用，便于后续切片。

脱水

将固定后的样本置于脱水剂中，逐渐脱去组织中的水分，以免在后续处理中产生冰晶，常用的脱水剂有乙醇、丙酮等。

透明

脱水后的样本需经过透明处理，使样本中的脱水剂被透明剂取代，以便后续浸蜡处理，常用的透明剂有二甲苯、苯等。

脱水、透明与浸蜡处理

包埋

使用切片机将蜡块切成薄片，切片厚度一般为4-8微米，切片过厚或过薄都会影响染色效果。

切片

贴片

将切好的薄片用镊子或载玻片轻轻贴附于载玻片上，使其平整无气泡，然后进行烘干或烤片处理，使组织切片牢固地附着在载玻片上。

将浸蜡后的样本放入模具中，加入熔化的石蜡，冷却后形成蜡块，以便切片。

包埋、切片与贴片

03

免疫组化染色

选择与待测抗原特异性结合的抗体，避免非特异性结合。

抗体特异性

根据抗体的效价和实验要求，确定适当的稀释比例，以保证染色效果。

稀释比例

选择稳定性好的抗体，避免在染色过程中失活或变性。

抗体稳定性

抗体选择与稀释比例确定

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通过加热处理，使组织中的抗原重新暴露，提高抗原与抗体的结合率。

抗原热修复

酶消化修复

抗原修复液选择

利用酶的作用，去除组织中的部分物质，使抗原得以暴露。

根据不同的抗原和组织类型，选择合适的修复液进行处理。

抗原修复技术

包括组织切片、脱蜡、水化等步骤，确保组织片干净、透明。

染色前处理

将抗体滴加在组织片上，孵育一定时间后，加入二抗进行显色。

染色过程

控制染色时间和温度，避免非特异性染色和背景过深；及时冲洗，防止抗体残留导致染色不均。

注意事项

免疫染色步骤及注意事项

04

显微镜观察与图像分析

切片要薄而透明，染色要均匀，避免色素沉淀。

样本制备

按照从低倍到高倍的顺序进行观察，确保找到目标区域。

显微镜观察

调节焦距、光线和镜头，以获得清晰的图像。

显微镜的调节

显微镜操作技巧

高分辨率CCD相机或CMOS相机，确保图像清晰度。

图像采集设备

Image-ProPlus、ImageJ等软件，用于图像的分析和处理。

图像处理软件

包括图像裁剪、旋转、调整亮度和对比度等，以便更好地观察和分析。

图像处理功能

图像采集与处理软件介绍

阳性细胞计数

阳性细胞比例

灰度值分析

数据统计分析

通过计算阳性细胞的数量来评估蛋白质的表达水平。

计算阳性细胞占总细胞的比例，以评估蛋白质的表达程度。

通过测量图像的灰度值来评估蛋白质的表达强度。

使用统计软件（如SPSS、GraphPadPrism等）进行数据分析，以确定实验组与对照组之间的差异是否具有显著性。

定量分析与统计方法

05

实验结果解读与报告撰写

阳性结果判断

通过抗体与抗原结合形成的免疫反应，检测样本中是否存在目标抗原。

免疫组化结果解读原则

01

阴性结果判断

抗体与抗原未结合，样本中不存在目标抗原或抗原含量极低。

02

对照实验分析

设立阳性和阴性对照实验，排除非特异性染色和假阳性结果。

03

结果半定量分析

根据染色强度和阳性细胞比例，对结果进行半定量评估。

04

结果描述

客观、准确地描述实验结果，包括阳性、阴性和对照实验结果。

实验目的和背景

简要说明实验目的、研究背景和实验设计。

结果分析与讨论

对实验结果进行解释和分析，结合文献和已知事实进行讨论。

材料和方法

详细描述实验所用试剂、仪器、操作步骤和注意事项。

结论

根据实验结果得