辐照法灭活烈性病毒剂量确定方法.docxVIP

1

辐照法灭活烈性病毒剂量确定方法

1范围

本文件规定了辐照设备要求、病毒灭活评价方法与结果判定、类比病毒预备试验、烈性病毒辐照灭活试验等规范要求。

本文件适用于在BSL3、BSL4实验室，使用小型加速器辐照装置确定烈性病毒最低有效灭活剂量的实验方法。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

消毒技术规范（2002年版）卫生部(卫法监发〔2002〕282号)

WS/T775-2021新型冠状病毒消毒效果实验室评价标准

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

病毒灭活virusinactivation

通过物理或化学方法使病毒失去感染性。

3.2

吸收剂量absorbeddose

电离辐射授予质量为dm的物质的平均能量dε除以物质质量dm的商。吸收剂量单位为“戈瑞”符号为Gy，1Gy=1J/kg。

3.3

最低有效灭活剂量minimumeffectivedose

为达到灭活病毒目的所需要的最低吸收剂量，即工艺剂量下限值。

3.4

病毒滴度Virustiter

单位体积液体中具有感染能力病毒的数目。

3.5

TCID50（Mediantissuecultureinfectivedose）

半数组织培养感染剂量,即指能在半数细胞培养板孔引起细胞病变(cytopathiceffect,CPE)的病毒量，是病毒滴度常用的测量方法。

4辐照设备要求

2

4.1技术要求

使用小型电子加速器对病毒进行灭活处理，设备要求如下：

a)电子束能量大于150keV；

b)单次辐照吸收剂量0～150kGy；

c)泄露剂量：＜1.0uSv/h（距离设备表面10cm处）；

d)设备尺寸能进入BSL3、BSL4实验室。

4.2使用要求

a)使用单位应取得《辐射安全许可证》或地方环保部门的行政许可；

b)操作人员需参加设备操作的专题培训。

5病毒灭活评价方法与结果判定

5.1试验原理

用细胞感染法测定辐照处理前后（或对照组与实验组）样本中病毒的量。以细胞病变作为判断指标，使用TCID50方法确定各组病毒的感染滴度，观察不同辐照吸收剂量对病毒的灭活效果。

5.2病毒感染性定量测定方法

TCID50细胞体外感染法，用Behrens和Karber法计算TCID50值。

5.3病毒灭活辐照剂量判定

灭活试验结果符合以下全部条件，可判定辐照灭活病毒的有效性：

a)阴性对照组细胞生长正常；

b)阳性对照组病毒滴度对数值应≥4.0；

c)灭活试验组细胞无病变，与阴性对照组细胞生长情况一致。

其中满足上述判定标准获得的辐照剂量做小值，即为最低有效辐照灭活剂量。

6类比病毒预备试验

6.1类比病毒筛选

对烈性病毒进行辐照灭活试验时，可先选用类比病毒进行预实验，具体如下：

a)所选类比病毒应和拟开展试验的烈性病毒属于同一种属；

b)所选类比病毒应属于低致病性或宿主为非灵长类的病毒，可在低安全等级实验室开展相关试验。

6.2类比试验要求

a)对类比病毒采取的辐照灭活试验方法、条件等应与拟开展试验的烈性病毒一致，辐照灭活剂量结果以供后续参考；

b)最终结果以拟进行辐照灭活试验的烈性病毒为准，类比病毒试验结果仅供参考。

7烈性病毒辐照灭活试验

7.1病毒载体材料

3

不锈钢钢片和聚丙烯塑料片。不锈钢钢片为12mm直径圆形片(厚0.5mm)，聚丙烯塑料片为10mm×10mm方形。

7.2操作步骤

a)病毒载体的制备:取灭菌载体片，滴染病毒晾干备用。

b)灭活试验:取病毒载体置于细胞培养板中，并进行密封处理，再放入小型辐照仪器内腔中，设置辐照剂量后，作用至规定的时间取出，放入1mL维持培养基中，作用10min,混匀洗脱。

c)对照组试验:阳性对照组为病毒对照组，观察病毒生长是否良好，病毒滴度是否达到试验要求；阴性对照组用维持培养基作为阴性对照，观察有无污染，细胞生长是否良好。

d)以上各组按照终点稀释法分别进行病毒滴度测定。试验重复3次。

e)根据5.2测定方法和5.3判定标准，确定2种载体下最低有效灭活剂量，最后取两者较大者为试验灭活剂量。

具体参照《新型冠状病毒消毒效果实验室评价标准》中载体制备和载体法灭活试验。

4

附录A

（规范性附录）

辐照设备剂量标定方法

一、剂量计：采用GEX公司生产的B3薄膜剂量片。

二、测试仪器和工具：

1、分光光度计：能提供520nm光波波长；波长精度±2nm；波长重复性≤1nm；投射比准确度

±0.5%（T