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宿主细胞残留蛋白(HCP)检测的法规要求和方法选择

1、HCP概念和检测的必要性

生物制品通常是通过重组技术经由宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞）进行生产的，产品类型包括单克隆抗体、重组蛋白和疫苗等。这些产品的制造和纯化过程不可避免的会引入宿主细胞蛋白（HostCellProtein，HCP）杂质，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞分泌的促生长因子等，是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物。尽管使用先进的纯化技术，但一些宿主细胞蛋白仍将作为工艺相关杂质残留在中间药物产品中。

这些杂质有潜在的免疫原性，也可能作为佐剂增强生物药物的产品的免疫反应，还会影响产品的稳定性和功效，从而引发人体安全性风险，因此，对于HCP的去除水平需要建立合适的监测策略，并控制终产品中HCP的含量以符合药物质量的要求。

2、HCP法规监管要求

生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性(CQA)，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。各国法规都有涉及HCP的论述，要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。对HCP的接受程度将根据具体情况进行评估，并取决于多个因素，其中包括：剂量、给药频率、药物类型和疾病严重程度。

《中国药典》三部（2020版）规定：针对CHO细胞，HCP残留需要0.05%（相当于小于500ppm）；针对E.coli，HCP残留需要0.01%。

美国药典USP1132章节规定：用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCP，其含量应该低于检测限（通常小于100ppm，即1mg总蛋白中HCP含量应小于100ng，也即0.01%）。

欧洲药典EP2.6.34中规定：在生物制品中，HCP的含量应当小于0.1%。

国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南：ICHQ6B指出，需要根据ICH准则采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP，其残留量通常要求小于100ppm。

由此可见，监管机构对于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工艺开发必须经过HCP检测，并证明纯化工艺能够将HCP降低到安全水平，并且在最终产品的残留量限值中，中美的推荐限度值均在0.01%以下。

3、HCP检测方法

酶联免疫吸附法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，在2020版《中国药典》通则3412/3413/3414中提到的宿主蛋白残留检测方法均为ELISA法。

美国药典USP1132章节中也提到可采用电泳法、ELISA和LC-MS/MS等方法检测HCP含量，且由于ELISA法操作简便、快速、高灵敏、高通量等特点，而被推荐为HCP检测的首选方法。

1、酶联免疫吸附测定(ELISA)

用途：

检测HCP中蛋白的总量，可用于产品开发和过程控制，目前是检测HCPs的常用方法。

优势：

高灵敏度和特异性；

高通量及可实现自动化；

定量性；

操作简便、快速。

劣势：

需要特异性抗体；

无法特异鉴别和评估单个HCP；

方法开发较为复杂，抗原需要特殊制备；

方法的影响因素较多，HCPs覆盖率需评估；

无法鉴定出种类。

2、免疫印迹(WesternBlotting)

用途：

用于大量样品的一致性筛选，以及检测与抗HCPs抗体反应的未知蛋白。适用于检测HCPs,并提供HCPs相对分子质量的大概信息。

优势：

特异性；

结果直观可视化：通过蛋白质大小和表达水平的差异进行可视化；

可检定和定量特定的HCP。

劣势：

半定量性；

仅限于特定蛋白：只能检测到与抗体结合的HCP；

对复杂蛋白质混合物不够敏感；

蛋白质SDS变性可能导致构象表位的丢失；

灵敏度需依赖多克隆抗体质量。

3、二维凝胶电泳法(2-DE)

用途：

常用于上游或下游工艺开发和表征，其可在单一凝胶上分辨不同HCPs。

优势：

不需要免疫印迹，避免了转膜的问题；

可以实现痕量HCPs杂质与产品的分离；

提供大概相对分子质量和等电点信息。

劣势：

过量的蛋白可能会掩盖HCPs斑点；

可观察到样品中HCP的分布，但无法量化。

4、质谱分析(MassSpectrometry)

用途：

鉴定单个HCP，提供准确的宿主细胞蛋白鉴定和定量信息

优势：

高分辨率和准确性；

鉴定及监控各个HCP；

提供HCP的全面谱图；

能够覆盖广泛的蛋白质；

可鉴定出HCP种类。

劣势：

设备和技术要求高；

操作较为复杂；

成本较高；

方法通量低；

较为复杂的样品前处理；

潜在的基质影响；

需要专业的数据分析能力。

ELISA是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法，可以测定HCP的总量，但其存在局限性，无法鉴别HCP的种类及丰度，需要其他方法与之互相补充。每种检测方法都各有其优缺点，在实际应用中，可以根据实验目的、样品特性、准确性和操作便捷性等方面进行选