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酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定--第1页
西安交通大学实验报告
成绩
课程：实验日期：2012年月日
专业班级：组别交报告日期：2102年月日
姓名：学号报告退发：（订正、重做）
同组者：教师审批签字：
实验名称：酪氨酸酶的粗提取、分离纯化、纯度鉴定及活性测定
实验目的：
1.自行查阅资料，选取原材料，设计合理的酪氨酸酶提取、分离、纯化鉴定以及
活性测定的方案；
2.按照实验方案，自主进行实验并对实验方案进行评价和改进；
3.通过酪氨酸酶的分离过程，了解并熟悉生物工程下游分离工程的一些常规操
作；
4.对实验结果进行总结，分析和汇总展示，培养分析问题和自我展示的能力。
实验原理：
酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物体内。与生
物体黑色素的合成直接相关。近年来，有学者已经从各种植物中提取得到酪氨酸
酶，如马铃薯，蘑菇，香蕉，苹果，桑叶以及香樟等。相关资料显示，L-多巴和
邻苯二酚测定体系都说明香蕉，马铃薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性较高。因此，本
实验选取香蕉为实验原材料，通过简单的提取分离以及纯化，初步得到了酪氨酸
酶的样品（溶液），并用邻苯二酚为底物对其活性做了定性鉴定。
酪氨酸酶的粗提取包括研磨（匀浆），过滤，离心，盐析和透析等过程。盐
析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。随着溶液中离子
强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。同时由于盐的
水化作用使蛋白质表面的疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出来，增大了蛋
白质表面的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。盐析的方法有K盐析法
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酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定--第1页
酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定--第2页
和β盐析法，前者是改变体系的离子强度，而后者的则通过改变温度和pH实现。
由于蛋白质对离子强度的变化十分敏感，所以常采用K盐析法。常用的盐有硫
s
酸铵等。通过查阅资料，本实验中采用饱和度为55%的硫酸铵进行酪氨酸酶的盐
析沉淀。透析是一种膜分离的方法，利用的是浓度引起的自由扩散，在透析袋内
盛放盐析后酪氨酸酶的溶解液，放入缓冲液内透析，目的是除去盐析过程带入的
离子。透析袋在使用前一般需要进行预处理。
通过以上操作可得到酪氨酸酶的粗酶液。粗酶液需要进一步的分离纯化。离
子交换色谱法是一种利用离子交换剂作为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂间
静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。离子交换色谱法洗脱的方式
有恒定洗脱，线性梯度洗脱和逐次洗脱的方式。使用离子交换色谱时，首先需要
填充固定相，如果是干粉还需要溶胀，填充的色谱柱不能有气泡，否则会影响分
离结果。上样前需要先用上样缓冲液平衡，上样后需要用有一定离子强度的洗脱
液洗脱，获得蛋白质样品。
经离子交换色谱柱纯化后的样
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