微生物与免疫学-实验四-酶联免疫吸附实验-ELISA(共34张PPT).pptx

ELISA简介;ELISA基本的实验过程;ELISA检测抗原;ELISA检测抗体;ELISA检测抗体(间接法);由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。;酶标板;酶标仪;一、ELISA法间接法检测血清中HBsAb;将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成）;将待测血清加入，温育，血清中如有HBsAb，则抗原抗体结合;加入酶复合物，(HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合;加入酶的底物，酶与底物反应，显色;;ELISA检测抗体(间接法)

3．白板?

（阳性对照不显色）?

?（1）漏加酶结合物；

临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因?

（非试剂盒本身的原因）

（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H2O2）

一、ELISA法间接法检测血清中HBsAb

1．熟悉ELISA的原理。

（2）加样过快，孔间发生污染；

（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*

将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成）

2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。

滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。

二、ELISA间接法检测血清中HBsAg

（2）加样过快，孔间发生污染；;

;同上洗涤重复5次，拍干。

“大三阳”急慢性乙肝患者（传染性强）

加入酶的底物，酶与底物反应，显色

（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

Ag+Ab1Ag-Ab1

2．测定的重复性差?

?（相同样本两次测定结果不一致）?这是典型的由测定操作引起的问题，包括?

（1）加样本及试剂量不准；

HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单??区。

ELISA基本的实验过程

HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。

原理同检测抗体,但小孔底部包被的为HBsAb

阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;

2．了解免疫标记技术的原理。

（2）加样过快，孔间发生污染；

此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。

包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化;实验步骤;3、检测方法;;(2)每孔加1滴酶结合物,充分混匀，37℃孵育30min

(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；

(4)每孔加满洗涤液,静置1min,甩干。同上洗涤重复5次，拍干。

;

(6)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min.按以下方法,进行肉眼观察结果:

阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;

待测孔显蓝色,为阳性,否则为阴性。

(7)加终止液（本实验不加终止液）;4结果记录及结论;HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。

在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。

HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)组成。三种抗原具有其相应抗体：HBsAb（抗表面抗原抗体）、HBeAb（抗e抗原抗体）、HBcAb（抗核心抗原抗体）。;HBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为HBV感染的主要标志；

HBcAg存在于Dane颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被HBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV处于复制状态；

HBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及DNA多聚酶消长基本一致，故HBeAg为HBV复制及具有强感染性的一个指标；

;HBeAg刺激机体产生的抗-HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，抗-HBe的出现是预防后良好的象征。

HBV的主要感染源是患者或无症状的HBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。

本实验只检测HBsAg及其抗体HBsAb

;HBsAg（本实验测）;【注意事项】

1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。

2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平