实验五层析实验.ppt

****实验五层析技术离子交换层析薄层层析纸层析凝胶过滤层析HPLC

层析法又称色谱法（Chromatography）是利用混合物中各组分理化性质（如溶解度、极性、吸附力、亲和力、电荷和分子量等）的差异，将多组分混合物中的物质进行分离、分析和纯化的一种技术是利用混合物中各组分在两相（固定相和流动相）间进行分配。当流动相携带混合物经过固定相时，即与固定相相互作用，由于各组分的理化性质、分子结构等的不同，使得待分离物质与固定相的作用程度存在着差异（即不同组分具有不同的分配系数），不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而随流动相移动的速率也有所不同，最终达到各组分彼此分离的目的。是生物样品或生物分子分离分析的重要方法之一。基本概念1．固定相（stationaryphase）：是由层析基质组成，包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与有关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。2．流动相（mobilephase）：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析时，又称洗脱剂。在薄层层析时又称展层剂。3．分配系数（partitioncoefficient，K）：指某一组分在固定相与流动相中浓度的比值。K=CA/CBCA：物质在A相(固定相)中浓度，CB：物质在B相（流动相）中的浓度4．迁移率（Rf）：指某一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。几种常用的层析方法1．吸附层析（adsorptionchromatography）：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能力的差异进行分离。当各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对待分离混合物中各组分的吸附力不同，导致各组分随流动相移动的速度不同，最终使得混合物中的各组分得以分离。吸附层析的效果如何取决于待分离物质被吸附剂（固定相）吸附结合的能力，以及其在流动相中溶解度的差异。氧化铝、硅胶等物质吸具有吸附其它物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同，是最为常用的吸附剂。薄层层析是吸附层析的一种类型。薄层层析（thinlayerchromatography）：将固定相（吸附剂）在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。通过硅胶对不同的脂类物质具有不同的吸附能力（亦存在两相溶剂中的分溶分配作用）。在展开剂（移动相）展层过程中脂类物质在两相之间重复进行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各种脂类物质随展开剂移行。与固定相（硅胶）吸附能力弱的和/或在移动相中溶解度大的脂类物质随展开剂移行到较远的距离，而与固定相吸附能力强的和/或在移动相中溶解度小的脂类物质，在展开过程中移行慢，落在后面，这样展开一段时间后将各种脂类物质彼此分离开来。1薄层层析是一项常用的分离、鉴定脂类的技术。2本实验以硅胶G作固定相，以石油醚-丁酮-乙酸混合溶剂为流动相。3样本：胆固醇，卵磷脂，三油酸甘油酯，菜油，卵黄4【基本原理】薄层层析分离脂类【操作步骤】1．层析薄板的制作：称取硅胶G2g置研钵中加入0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速倒在8cm×12cm玻片上，水平放置，使分布均匀，待其凝固后，置100℃烘箱中烘干备用。2．点样及展层：分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5cm高度处取间距为1cm点样，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸入展开剂中。3．显色：约半小时后，当展开剂上升至适当高度（接近薄板上端）将薄板取出烘干，喷以磷钼酸显色剂,烘干.比较各种脂质和试样所显斑点位置，作图记录之，计算Rf值，即斑点中心至原点的距离（cm）／展开剂扩展前沿至原点的距离（cm）。2.分配层析（partitionchromatography）利用不同物质在流动相和固定相之间的溶解度和分配系数不同，使物质分离。溶剂之一通常是水，它是保持在固定的支持相之中（用淀粉、纤维素粉、滤纸等惰性材料制成），另一溶剂是移动相，由水饱和的有机溶剂组成。被分离的物质，如果彼此之间分配系数相差较大，就容易被分离开。纸层析（paperchromatography）：以滤纸作为支持物的分配层析纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。1纸