实验三细菌的革兰氏染色及芽孢染色法.pptVIP

实验三细菌的革兰氏染色及芽孢染色法（一）实验目的：1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。

2、巩固显微镜油镜的使用技术。（二）实验原理：革兰氏染色原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。2、芽胞染色法原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。（三）实验器材1、活材料：革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillussubtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillussubtilis）2、染色液和试剂：革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红；芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液；二甲苯、香柏油。器材：载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。革兰氏染色：1涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。2干燥：与简单染色法相同3固定，与简单染色法相同4初染：加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染色液染色1-2分钟5水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗6媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min7（四）实验步骤水洗：用水洗去碘液。脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。复染：滴加蕃红复染2min。水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。3214560102Schaeffer与Fulton氏芽孢染色法涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。干燥：与简单染色法相同固定，与简单染色法相同染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后用木夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。126543水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。复染：用蕃红液染色2min。水洗：干燥：镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。123456