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蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告

学院：生物科学与工程学院

专业：生物技术

班级：1班

姓名：

学号：

摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2]。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。

关键字：蛋白酶生长曲线酶活力

3.2.1标准曲线的制作

管号

酪氨酸标准溶液的浓度ug/ml

取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml

取去离子水的体积ml

加0.4mol/L的碳酸钠溶液的体积ml

加福尔马林的体积ml

测定OD680值（A）

0

0

0.0

1.0

5.00

1.00

0

1

10

0.1

0.9

5.00

1.00

0.089

2

20

0.2

0.8

5.00

1.00

0.179

3

30

0.3

0.7

5.00

1.00

0.353

4

40

0.4

0.6

5.00

1.00

0.479

5

50

0.5

0.5

5.00

1.00

0.518

加完之后，置于40+0.2水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值。

计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=88.28。

3.2.2酶活力数值计算：

X=A×K×4/10×n

?式中：X——样品的酶活力，U/mL；A——样品平行试验的平均吸光度；K——吸光常数；4——反应试剂的总体积，mL；10——反应时间10min，以1min计；n——稀释倍数。所得结果表示至整数。

第四章试验方法

4.1试验流程

培养基的配置→活化菌种→培养取样→标准曲线绘制、生长曲线绘制和酶活测定

4.2培养基的制备

4.2.1牛肉膏蛋白胨培养基制备

配方：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水1000ml、pH7.0~7.2、121℃灭菌20min。

4.2.2酪素培养基制备

牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。

4.3菌种活化

将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150ml液体发酵培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的250ml三角瓶中，30-32℃摇瓶发酵，在摇床里30℃震荡培养16到18小时，目的在于活化菌种并得到对数期菌种。在培养瓶中进行发酵。

4.4试剂的配制

4.4.1福林-酚试剂：向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4.2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

4.4.20.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液

精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

4.4.30.4mo1/L碳酸钠溶液

精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

4.4.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L

4.4.5盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L

4.4.6磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠(Na,HP0,·12H,