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蛋白质的提取与检测

细胞总蛋白的提取及含量测定

【基本原理】

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA（Bicinchoninicacid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuretreaction）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

【试剂配制】

1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174gPMSF溶解于100ml异丙醇，分装于1.5ml离心管中，-20

细胞裂解液：50mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，1%TritonX-100

100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）：BSA0.1g，0.15mol/LNaCl1ml，充分溶解后-20℃

0.15mol/LNaCl：0.877gNaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。

考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存

PBS缓冲液（pH7.4）：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4?12H2O3.63g，KH2PO40.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至1L，常温保存备用。

【操作步骤】

一、细胞总蛋白的提取

人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下常规培养

去除培养液后以预冷的PBS冲洗2～3遍。

加入适量的预冷的裂解液后置于冰上20～30min，不时摇动。

用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，转移将细胞碎片和裂解液至预冷的1.5ml离心管中；。

4℃、12000rpm离心15min。

将上清分装至1.5ml的EP管中，-20℃

5×Loadingbuffer：50%甘油，250mMTris-HCl（pH6.8），10%β-巯基乙醇，2.5‰溴酚蓝，10%SDS。混匀后，分装于1.5ml离心管中，

10%过硫酸胺（AP）：0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离子水，4℃保存，保存时间为2

四甲基乙二胺（TEMED）：分装少量原液于棕色瓶，4℃避光

30%Acr/Bic（37.5:1）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入适量去离子水于37℃下充分溶解并定容至100ml，4

注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积累，应戴手套进行操作。

凝胶脱色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存。

考马斯亮蓝G250蛋白染色液：0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中，混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。

凝胶保存液：450ml脱色液中加入50ml甘油，混匀后室温保存。

SDS浓缩胶（5%Acrylamide）配方：

分离胶配方

【操作步骤】

一、凝胶的配制与电泳

（1）凝胶配制与上样

玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

配制10%浓度的分