生化实验-血清醋酸纤维素膜电泳.ppt

分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度，即“电泳纯”。利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白呈4-5高峰即界面电泳。血清醋酸纤维素

薄膜电泳实验三电泳技术分光光度技术层析技术离心技术生物化学的四大研究技术：010203带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。电泳技术KaurinTiselius(1902-1971)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖1948诺贝尔生理医学奖。1809年，俄国物理学家Peиce首次发现电泳现象；1937年，KaurinTiselius发明了Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳，首次证明人血清蛋白的组分；1948年，Wieland和Fischer以滤纸作为支持介质的电泳；1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成凝胶作为介质——聚丙烯酰胺凝胶电泳:生物大分子的“LastCheck”！（－）（+）----------------------------表面带负电荷++++++++++++++++带正电荷的水层（－）（+）+++++++++++++++++表面带正电荷---------------------------带负电荷的水层++电泳的影响因素：影响电泳迁移率的外界因素：电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量质点的大小和形状凝胶电泳粉末电泳线丝电泳纤维膜电泳等按其介质的物理性状不同可分为：05自由界面电泳区带电泳根据电泳中是否使用支持介质分为：01连续pH电泳不连续pH电泳根据电泳系统pH是否连续分为：02水平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳按支持物的装置形式不同分为：03细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳等根据电泳物质类别不同分为：04电泳的分类血清醋酸纤维素薄膜电泳本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。基本原理试剂巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液01材料血清，醋酸纤维素薄膜01器材电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。01试剂和耗材准备醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划线即为点样线并作好标记。1234操作步骤点样（关键）在薄膜的粗糙面点样。点样时，先用吸管将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约1~2mm。注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。3.电泳将点样后的薄膜使粗糙面（点样面）向下，点样端置于负极，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平衡5min。打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至90-100V左右，电流强度为0.4～0.6mA/cm薄膜条宽，电泳时间40min-1h左右。1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板点样端1电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。染色用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。漂洗2分清薄膜的点样面注意点样