生物显微技术第五章原位杂交.ppt

取材：根据需要把材料切成3-5mm的小块迅速投入，液氮中，-70oC保存。1切片：10μM，-70oC保存2室温干燥30分钟或50oC、2min3固定：4%多聚甲醛（pH9.5）室温固定1小时4洗涤：1×PBS，2×3min5蛋白抽提：1%Tron-100，室温20min6预杂交室温15min，7预杂交液：5×SSC，50%甲酰胺8杂交：55oC，16小时以上50%甲酰胺02%BSA杂交液：5×SSC250μg/mlTrna10%硫酸葡聚糖μg/ml变性探针杂交后处理：杂交后处理：50%甲酰胺5×SSC，15min×1，55oC50%甲酰胺2×SSC，30min×1，55oC50%甲酰胺0.2×SSC，30min×2，55oC0.2×SSC，5min×1，室温Buffer15min×1，室温1%Blooking1hr室温0.5%Blooking+碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1：50004oC过夜原位杂交组织化学固相杂交:菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）斑点杂交法（Dotblot）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）液相杂交定义：特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。DetectionofDNAbynucleicacidhybridization分类核酸探针标记方法：放射性探针：32P3H35S非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：DNA探针：单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）cDNA探针：complementaryDNAprobecRNA探针：complementaryRNAprobe寡核苷酸探针原理010203探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。优点能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。应用特定的核酸序列在染色体中的精确定位。01与细胞内的RNA杂交观察该基因的定位、定量表达。02用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。03原位杂交流程探针的标记取材切片:石蜡切片冰冻切片杂交前预处理杂交杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针探针的检测探针的标记DNARandomprimedlabelingRNAprobelabeling原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性TritonX-100消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等消化乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。杂交杂交的温度Tm：能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（meltingtemperature,简称）。Tm相关因素：CG含量；核酸的匹配程度；DNA探针：Tm是90℃，RNA探针：Tm是95℃。甲酰胺可降低杂交Tm：反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。高盐可降低Tm值苛刻复性温度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻复性温度：Tns=Tm–(30或35℃)Tm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一L1D：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA10DNA：RNA5RNA：RNA02％GC：杂交体中G十C碱基的百分比。3[Na＋]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。4F：是由甲酰胺引起的Tm下降常数，在DNA：DNA、DNA：RNA和RNA：RNA杂交中，F值分别为0.65、0.5和0.35。5(％formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比