生物制品的制备.ppt

分离纯化的基本过程（basicprocessofisolationanddepuration）分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。分离纯化一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。流程如下图所示。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品图3-8基因工程制品分离纯化的一般流程三、分离纯化的技术（techniqueofisolationanddepuration）分离纯化技术应满足下列要求：①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；②选择性要好，达到较高纯化倍数；③收率要高；④要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；⑤整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。细胞破碎与固液分离（cellcrashingandsolidandliquidisolation）以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物，分离需经细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。细胞收集（cellcollection）：常用离心分离，膜过滤法细胞破碎（cellcrashing）：细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法。机械破碎法速度快，处理量较大，不会带入其它化学物质；但要产生热量，要采取冷却措施，防止失活。1现常用方法有：高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。2高压匀浆器，利用高速造成的剪切、碰撞以及高压到常压的变化，使细胞破碎。3超声波破碎法是小量细胞破碎普遍使用的方法，用声频高于15～20KHz，其破碎机制可能与空化引起的冲击波和剪切力有关。4X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。高速珠磨法设备是珠磨机，原理是细胞悬液与极细的玻璃小球、瓷球、石英砂等研磨剂快速搅拌研磨，利用珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。010201非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。酶溶法必须选择合适的酶，控制好温度、pH和酶用量。化学渗透法得用一些有机溶剂（苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂（SDS、Triton）、金属螯合剂（EDTA）、变性剂（脲、盐酸胍）等。010203分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相（通常为下相）而分离，也起部分纯化作用。包括高速离心和超速离心。膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等，微滤用于分离细胞、细胞碎片、包含体和蛋白质沉淀物等固体颗粒；超滤用于浓缩蛋白质、多糖和核酸等大分子物质；反渗透用于脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。（3）固液分离（solidandliquidisolation）双水相萃取系统是由两种水溶性高聚物或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成，常用的双水相系统有聚乙二醇-葡聚糖和聚乙二醇-无机盐。聚乙二醇-无机盐应用广泛。聚乙二醇富集的上相一般会有目的产物和其他杂蛋白，下相含有细胞碎片、核酸、多糖等。需要综合考虑聚乙二醇浓度、无机盐浓度、PH等诸多因素。目的产物的分离纯化（isolationanddepurationofproduction）固液分离之后，目的产物仍与大量的杂质混合在一起，这类杂质可能有病毒、热原质、氧化产物、核酸、多聚体、杂蛋白、与目的物类似的异构体等。分离纯化主要依赖色谱分离方法。该法是设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为①离子交换色谱、②疏水色谱、③反相色谱、④亲和色谱、⑤凝胶过滤色谱、⑥高压液相色谱等。选择纯化方法尤其重要的根据是表面性质的差异。离子交换色谱（ionexchangechrom