目的基因的分离和克隆.pptVIP

第四章??????目的基因的分离和克隆第一节???????目的基因的获得01.第二节???????获得目的基因方法的选择02.第三节???????目的基因重组体的构建03.01020304聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因建立基因组DNA文库构建cDNA文库筛选目的基因化学合成05其他方法第一节???????目的基因的获得化学合成法自动化DNA合成仪要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列较短的DNA片段，有专一性和定向性原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。010203应用范围：1）合成PCR引物寡核苷酸探针人工接头及较小的基因基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体。特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小二、建立基因组DNA文库2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）⑴分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA⑵制备全部基因组的DNA片断①机械断裂法用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用②限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。01020304DNA片断与载体的连接包装酵母人工染色体基因组DNA+λ噬菌体——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌噬菌斑常用载体：粘性质粒λ噬菌体基因组DNA+粘性质粒——重组DNA——转化细菌菌落1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。0506基因组文库大小的计算1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1－P）N=———————In（1－f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？In（1－0.99）N=———————————————=9.2×106In（1－1.5×103／3×109）若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA～500转化子／μgDNA表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用