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超高效液相色谱-串联质谱法和胶体金快速定量法测定牛奶中黄曲霉毒素M

一、引言

(1)黄曲霉毒素M（AflatoxinM1，AFM1）是一种强致癌物质，主要污染粮食和饲料，其中牛奶作为人们日常饮食中的重要组成部分，其安全性受到广泛关注。AFM1来源于黄曲霉菌，在适宜的温湿度条件下，黄曲霉菌可以在各种食品中生长繁殖，产生大量毒素。据统计，全球每年因黄曲霉毒素污染导致的农产品损失高达数十亿美元，严重威胁着人类健康和农业产业。

(2)随着食品安全意识的不断提高，对牛奶中AFM1的检测要求也越来越严格。目前，国际上对牛奶中AFM1的限量标准为0.5ng/g，我国也参照此标准制定了严格的检测法规。为了保障人民群众的饮食安全，相关部门对牛奶及其制品的AFM1检测工作高度重视。然而，AFM1的检测方法多样，传统方法如薄层层析法、酶联免疫吸附法等，存在着操作复杂、灵敏度低、易受干扰等缺点，已无法满足现代食品安全检测的需求。

(3)近年来，随着分析技术的发展，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和胶体金快速定量法等新型检测技术在食品中AFM1的检测中得到了广泛应用。UPLC-MS/MS技术具有高灵敏度、高专一性和快速检测等优点，能够满足牛奶中AFM1的超痕量检测需求。而胶体金快速定量法具有简便、快速、无需专业仪器等优点，适用于现场快速筛查。本文旨在对UPLC-MS/MS和胶体金快速定量法在牛奶中AFM1检测中的应用进行综述，为我国食品安全检测提供参考。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括牛奶样品、AFM1标准品、乙腈、甲醇、磷酸盐缓冲溶液、氨水、氯化钠等。牛奶样品来源于不同地区和品牌的牛奶制品，以确保实验数据的普遍性和可靠性。AFM1标准品购自国家标准物质中心，浓度为1ng/μL，用于标准曲线的制备。乙腈和甲醇为色谱级试剂，用于样品提取和净化。磷酸盐缓冲溶液用于调节pH值，氨水用于溶液的制备。氯化钠作为盐析剂，用于去除样品中的蛋白质和脂肪。

(2)超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测AFM1的实验步骤如下：首先，将牛奶样品用乙腈和磷酸盐缓冲溶液混合进行提取，然后通过固相萃取小柱进行净化。净化后的样品用流动相洗脱，收集洗脱液并蒸干。残渣用流动相复溶于适当体积的溶液中，进行UPLC-MS/MS分析。UPLC色谱柱为C18柱，流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速为0.4mL/min。串联质谱仪采用电喷雾电离（ESI）源，扫描方式为多反应监测（MRM），检测波长为220nm和235nm。

(3)胶体金快速定量法检测AFM1的实验步骤如下：首先，将牛奶样品用生理盐水进行稀释，然后滴加到预先准备好的胶体金试纸上。试纸上的AFM1抗体与样品中的AFM1结合，形成抗原-抗体复合物。随后，加入胶体金标记的AFM1抗体，如果样品中存在AFM1，则会形成红色的线条。通过比较样品条与标准曲线上的颜色深浅，可以快速、定量地检测牛奶中AFM1的含量。该方法操作简便，无需专业仪器，适用于现场快速筛查。

三、超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M的原理与操作步骤

(1)超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）是一种高效、灵敏的检测技术，在食品中黄曲霉毒素M（AFM1）的检测中具有显著优势。该方法的原理基于液相色谱（LC）的高分离能力和质谱（MS）的高灵敏度。AFM1在样品中被乙腈提取后，通过固相萃取（SPE）去除杂质，净化后的样品进入UPLC柱进行分离。UPLC柱通常采用C18反相色谱柱，流动相由乙腈和0.1%甲酸水溶液组成，流速控制在0.4mL/min。分离后的AFM1通过电喷雾电离（ESI）进入串联质谱仪，进行多反应监测（MRM）分析。MRM模式下，AFM1的两个特定碎片离子被同时检测，提高了检测的准确性和灵敏度。

(2)操作步骤首先涉及样品前处理，包括提取、净化和浓缩。提取过程通常使用乙腈，以高效提取牛奶中的AFM1。提取后的样品通过固相萃取柱进行净化，去除干扰物质。净化后的样品用流动相洗脱，收集洗脱液并在氮气下蒸干，以去除溶剂。随后，用流动相复溶于适当体积的溶液中，准备进行UPLC-MS/MS分析。在UPLC分析中，AFM1在C18反相色谱柱上得到分离，流动相的梯度洗脱有助于提高分离效果。串联质谱仪通过ESI源将AFM1离子化，并通过MRM模式检测两个特定碎片离子，实现高灵敏度检测。

(3)数据分析是UPLC-MS/MS检测AFM1的关键步骤。通过MRM模式获得的信号与标准品分析得到的信号进行比较，可以定量牛奶中的AFM1含量。标准曲线的制备是通过一系列已知浓度的AFM1标准溶液进行分析，得到峰面积与浓度的线性关系。在实际样品分析中，根据样品的峰面积从标准曲线上查找对应的AFM1浓度