Reg3g对大鼠肝星状细胞HSC-T6活化的作用及机制研究.pdfVIP

摘要

肝纤维化是指肝脏在胆汁淤积障碍、酒精/非酒精性脂肪肝、乙型/丙型肝炎等多种

原因导致的慢性肝损害，导致肝细胞出现炎症反应，肝星状细胞活化，生成大量的ECM，

并伴随着肝内结缔组织的异常增殖，最终导致肝纤维化。我们实验前期利用RatGenome

2302.0芯片对大鼠4种肝脏疾病组织进行了基因表达谱分析，发现Reg3g基因在肝硬

化模型中的表达显著上调，推测其可能参与肝纤维化的发生，但目前对其在肝纤维化中

的表达模式和对肝纤维化的主要活化细胞-肝星状细胞的作用机制缺乏了解，因此，本

文以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象，通过siRNA干涉Reg3g基因或转染Reg3g

过表达质粒使Reg3g基因发生下调或上调，利用细胞学及分子生物学方法探究Reg3g

基因对大鼠肝星状细胞HSC-T6的生物行为学影响，为进一步阐明Reg3g在肝纤维化发

展中的作用奠定基础和提供实验依据。

本文首先通过锐博生物公司构建Reg3g的3个siRNA干涉片段，通过qRT-PCR和

WesternBlot对构建的三个siRNA片段进行筛选，挑出最佳干涉效果的片段，之后用免

疫荧光法对siRNA的干扰效率进行检测，分别通过CCK8、EdU、划痕实验和PI色法

检测Reg3g敲降后对HSC-T6细胞的活力、增殖、迁移能力和周期的影响，利用Western

blot的检测si-Reg3g对HSC-T6细胞增殖、周期、凋亡、活化相关蛋白及其相关信号通

路的表达情况进行检测。结果表明在HSC-T6细胞中敲降Reg3g的表达，HSC-T6的活

力、增殖、迁移能力和周期均受到明显的抑制。WesternBlot结果表明，Reg3g基因敲

降使细胞增殖相关蛋白c-MYC和周期相关蛋白CCNE1的表达下降，同时使细胞凋亡相

关蛋白BAX和C-Caspase8的表达上调，增殖相关通路NF-κB(p65)的表达下降，此外，

Vimentin和细胞活化标志蛋白α-SMA均有所下降，静止型标志GFAP表达有所上升，

SMAD2/3的磷酸化水平显著性降低，说明NF-κB(p65)信号通路调控HSC-T6细胞的增

殖，可能通过TGF-β/SMAD2/3信号通路调控HSC-T6细胞的活化。

此外，通过使用LipoFiterTM转染试剂将pcDNA3.1(-)-Reg3g质粒瞬转进HSC-T6细

胞中，使其在HSC-T6细胞中的表达上调，通过CCK8、WesternBlot检测细胞活力及相

关蛋白的表达情况。CCK8结果表明，Reg3g过表达能显著提升HSC-T6细胞的活力。

WesternBlot结果表明，增殖相关蛋白c-MYC显著性上调，凋亡相关蛋白BAX和

C-Caspase8的表达均显著性下降，增殖相关通路NF-κB(p65)的表达显著性上调，

SMAD2/3的磷酸化水平显著性升高，与Reg3g基因敲降的结果形成对比，进一步证明

了Reg3g基因可能通过NF-κB(p65)信号通路调控HSC-T6细胞的增殖，通过

TGF-β/SMAD2/3信号通路调控HSC-T6细胞的活化。

关键词：Reg3g，HSC-T6，肝纤维化，细胞活化，siRNA

ABSTRACT

Liverfibrosisisapathologicalprocessafterchronicliverinjurycausedbyvariousfactors,including

alcohol,non-alcoholicfattyliverdisease,cholestaticdisorder,hepatitisBorC,etc.Thespecific

manifestationsaretheinflammatoryreactionofhepatocytes,theactivationofhepaticstellatecells,andthe

productionofalargenumberofextra