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RhoGTP酶抑制剂辛伐他汀和Y27632调控小鼠胚胎干细胞心肌

分化和自我更新机制研究

小鼠胚胎干(Embryonicstem,ES)细胞作为原始态全能性干细胞的典型代表,

以其易于维持和分化培养,而成为ES细胞全能性和分化调节剂研究的理想模型。

RhoGTP酶是细胞内重要的分子开关,对细胞骨架,增殖,细胞极性,基因表达等都

发挥了重要调控作用。研究表明,RhoGTP酶相关通路在ES细胞存活和自我更新

等方面也具有重要作用[14-16]。

因此该类蛋白相关的抑制剂在ES细胞全能性和分化领域也可能有潜在的应

用前景。目前针对RhoGTP酶的抑制剂大部分为间接抑制剂,即不与RhoGTP酶发

生直接相互作用。本研究所用的抑制剂中,辛伐他汀(Simvastatin,SIM)可通过

影响细胞脂代谢中间体的合成而影响异戊烯化介导的RhoGTP酶膜定位,从而发

挥活性抑制作用。

Y27632则为下游效应蛋白ROCK的特异性抑制剂。NSC23766是少数的直接抑

制剂,它与Rac1结合,阻止其被Rho鸟苷酸交换因子(Rhoguaninenucleotide

exchangfactor,RhoGEFs)激活；它们分别作用于RhoGTP酶信号通路的不同层

面,发挥各自的作用。本论文通过小鼠ES细胞增殖和定向心肌分化模型,采用小

分子抑制剂,探索了RhoGTP酶在这些过程中的作用,并围绕具有显著促分化作用

的SIM和显著促增殖作用的Y27632,分别探讨它们在调控ES细胞全能性和心肌

定向分化中的作用机制。

同时为探索ES细胞自我更新调控中的新分子事件,进一步采用microRNA芯

片及生物信息学方法对Y27632处理的细胞进行了相关研究和分析,以期发现调

控自我更新信号新的线索。1.辛伐他汀促进小鼠胚胎干细胞心肌分化机制研究目

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的：利用小分子化合物探索RhoGTP酶在ES细胞心肌分化过程中的作用,并揭示

相关机制。方法和结果：Westernblotting方法检测小鼠ES细胞及定向心肌分

化过程中RhoGTP酶蛋白表达发现,ES细胞和拟胚体(Embryoidbodies,EB)均表

达RhoGTP酶家族三个主要成员：RhoA、Rac1和Cdc42。

用ES细胞增殖和心肌分化模型分别对四个RhoGTP酶抑制剂进行作用研究。

结果发现SIM可促进ES细胞心肌分化,NSC23766则可抑制心肌细胞分化,提示

RhoA和Rac1在心肌分化过程中具有不同的作用。对SIM的促分化作用进行进一

步研究发现,SIM0.1μM,1μM和5μM浓度可以剂量依赖性促进心肌搏动率增加

和心肌特异性α-辅肌动蛋白(a-actinin)表达上调。

综合考虑后选择1μM浓度进行后续实验。时效样本的检测发现,贴壁分化第

4天开始,SIM组a-actinin表达显著上调,提示心肌细胞分化的加强。为确定SIM

发挥促分化作用的时间窗,我们对分化前期(贴壁分化1-3天),后期(贴壁分化

4-6天),及全程(贴壁分化1-6天)分别加药检测,发现全程加药的促分化作用最

佳。

免疫荧光检测发现SIM诱导的心肌细胞具有完整成熟的肌小节结构。对胞膜

胞浆蛋白分离检测显示,SIM可以减少RhoA的膜结合,其下游蛋白MYPT1的磷酸

化减弱,提示SIM减弱了RhoA相关信号转导。同时,蛋白免疫印迹检测到SIM