DB41T 1525-2018 猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30

B41

DB41

河南省地方标准DB41/T1525—2018

猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法

2018-01-03发布2018-04-03实施

河南省质量技术监督局发布

I

DB41/T1525—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。

本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，平顶山市动物疫病预防控制中心，商丘市动物疫病预防控制中心，国家食品药品监管总局。

本标准主要起草人：班付国、闫若潜、王翠、谢彩华、王淑娟、王东方、朱前磊。

本标准参加起草人：赵雪丽、王华俊、孙素芳、郭育培、陶顺启、刘敏、苑述友、苗连叶、杨海波、王李辉、王一、王磊、钱勇。

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DB41/T1525—2018

猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）实时荧光PCR检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。

本标准适用于对疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等组织样品及血液样品中病毒核酸的检测。

2试剂和仪器设备

除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。水为灭菌双蒸水或超纯水。

2.1试剂

2.1.1组织悬液、消化液Ⅰ、TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存。

2.1.2酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)、0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）、1×核酸电

泳缓冲液、阿氏液（见附录A），以上试剂4℃保存。

2.1.3消化液Ⅱ、阳性对照、阴性对照（见附录A），置-20℃保存。2.1.4PCV2实时荧光PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。

2.2仪器设备

实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），二级生物安全柜，恒温水浴锅，2℃~8℃冰箱，－70℃冰箱，组织匀浆器或研钵，单道微量移液器（0.1μL～0.25μL；0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～1000μL），真空干燥器（非必备）。

3样品的采集、处理、存放及运输

3.1样品的采集及处理

采集疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等靶组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，然后将悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。

3.2血清和抗凝血

用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液）2mL～3mL，再自耳缘静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无菌Eppendorf管中，编号备用。

3.3存放与运送

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DB41/T1525—2018

采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若超过24h，应放置低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。

4操作方法

4.1样品DNA的提取

4.1.1取1.5mL无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100μL，再加入500μL消化液Ⅰ和10μL消化液Ⅱ,吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；置55℃水浴30min~1h。

4.1.2分别加入500μL酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于4℃条件下12000r/min离心10min。

4.1.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5mL无菌离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15min。

4.1.44℃条件下12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体；不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700μL75%乙醇，轻轻混匀。

4.1.54℃条件下12000r/min离心5min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒