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多重连接探针扩增技术原理

多重连接探针扩增技术（MultiplexLigation-dependentProbeAmplification，MLPA）的原理主要基于DNA探针杂交和聚合酶链反应（PCR）技术。

一、基本原理

MLPA技术利用特异性探针与目标DNA序列进行杂交，然后通过连接酶将相邻的探针连接成一个可以被PCR扩增的分子。随后，使用PCR对连接好的探针进行扩增，并通过毛细管电泳或荧光标记检测技术分析扩增产物的数量和大小，从而判断目标序列的拷贝数或序列变异情况。

二、具体步骤

变性：涉及退火DNA链的分离，使双链DNA变成单链。

杂交：将DNA样本与特定探针杂交。MLPA是一种多路复用技术，可以同时使用多达60个探头分析每个样本，从而针对不同的位点。这些探针具有引物序列，在扩增过程中与PCR引物结合。此外，探针还具有与目标位点互补的杂交序列，使探针能够与DNA结合。两种探针将在DNA链的相邻位点杂交。

连接：使用DNA连接酶（如ligase-65）将两个探针结合在一起。连接酶是非常特异性的，如果探针与目标位点不匹配，连接酶将无法与探针结合，也不会发生扩增。因此，MLPA可以检测特定的点突变，甚至可以区分伪基因和真正的靶基因。

扩增：通过聚合酶链反应（PCR）对连接好的探针进行扩增。由于所有的探针都有相同的PCR引物序列，因此只需要添加一对通用引物就可以研究所有的目标。正向引物荧光标记，使分析过程可视化和得以定量。

检测：扩增后，用毛细管电泳分离片段。毛细管电泳根据片段的长度进行分离，并将不同长度的片段显示为峰值模式，称为电泳图。每个探针上的填充序列不同，每个扩增子都有不同的已知大小，因此在数据分析过程中可以对每个扩增子进行量化。

三、技术特点

高效：一次反应可以检测多达50个核苷酸序列拷贝数的改变，大大提高了工作效率。

特异：可以检测点突变，具有高度的特异性。

快速：一次实验可以在24小时内完成，操作简便。

经济：可以使用标准温度循环仪和毛细管电泳设备进行操作，成本较低。

四、应用领域

MLPA技术在多个领域展现出了其独特的价值，包括：

遗传性疾病研究：能够检测由基因组缺失/重复或由表观遗传异常所导致的疾病，如脊髓性肌萎缩症、假性肥大型肌营养不良、Prader-Willi/Angelman综合征等。

肿瘤研究：用于检测癌基因扩增或抑癌基因缺失，为癌症的早期诊断和个体化治疗提供依据。

产前诊断：通过对羊水或绒毛样本进行检测，可以及时发现胎儿是否存在染色体异常或其他遗传缺陷。

MLPA技术以其高效、特异、快速和经济的特点，在遗传性疾病研究、肿瘤诊断和产前诊断等领域得到了广泛应用。