免疫检测技术的基本原理.ppt

第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，运用已知的抗原检测未知的抗体或运用已知的抗体检测未知的抗原.将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测

免疫学检测技术的长处高度的敏捷性高度的特异性

免疫分析技术的应用常用的诊断技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术

凝集试验概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与对应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。1.直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性成果。①玻片直接凝集法：定性试验②试管直接凝集法：半定量试验

试管法半定量试验YYY+?玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512

2.间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC,乳胶颗粒)，再与对应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性成果。临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。YYY+→待检样品抗原吸附血球或乳胶颗粒反应凝集物

3.间接凝集克制试验先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性成果。例：乳胶凝集克制试验检测HCG(妊娠诊断)Y?YY环节1：将已知抗体与待检标本混匀＋Y?YY＋环节2：加入抗原吸附的乳胶颗粒混匀Y?YY抗原吸附乳胶颗粒成果判断：不凝集为阳性成果已知抗体待检标本

凝集反应

2.沉淀反应概念：可溶性抗原与对应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。类型：★单向免疫扩散★免疫比浊法★双向免疫扩散★对流免疫电泳

单向琼脂扩散试验

双向琼脂扩散试验

对流免疫电泳

测吸光度计算抗原或抗体的含量抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正有关免疫比浊法原理

3.中和反应如抗“O”试验4.免疫标识技术概念：用荧光素、酶、同位素等标识抗体或抗原用以测定对应抗原或抗体的技术称为免疫标识技术。常用措施有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。特点：敏感、特异、迅速，能定性、定量、定位。

免疫标识技术酶免疫标识技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标识技术

酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定措施，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不一样的酶选用不一样的底物，将得到不一样的颜色反应.

酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色360,450

420

2、标识措施戊二醛交联法过碘酸盐氧化法

戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶

戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶

过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环

标识免疫物的分离与鉴定1、分离目的：清除游离酶措施：盐析、柱层析2、鉴定抗体活性酶活性标识物纯度

ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕捉法测IgM抗体（