细胞生物学技术.ppt

PARTTHREE第二节细胞分离技术离心是研究各种细胞器和大分子基本手段。高速离心机：转速为10~25Kr/min；超速离心机：转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ。一、离心技术logo差速离心

(differentialcentrifugation)在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，分离不同大小的细胞和细胞器。差速离心中细胞器沉降的顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核糖体。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀密度梯度离心

(densitygradientcentrifugation)速度沉降:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。等密度沉降:适用于分离密度不等的颗粒。细胞电泳(cellelectrophoresis)一定pH下，细胞表面带正或负电，可在外加电场下发生泳动。各种细胞带电量不同(ξ电位)，在一定电场中的泳动速度不同。通过测定电泳速度可推算出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理和病理状态而异，在诊断疾病上有一定价值。第三节细胞组分分析方法揭示细胞内生物大分子物质的功能及其相互间的关系。一、细胞化学技术利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究。能显示蛋白质、核酸、酶、糖类、脂类、无机物等。1、Schiff反应(Feulgen反应)细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。金属沉淀法利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Electronmicrographofacellshowingthelocationofaparticularenzyme(nucleotidediphosphatase)intheGolgiapparatus.Athinsectionofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitateuponreactionwiththeenzyme脂染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，变成棕色化合物。免疫细胞化学（immunocytochemistry）根据免疫学原理，利用抗体同抗原特异性结合，对抗原进行定位。将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原反应，可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于细胞或组织中的部位。免疫荧光法(immunofluorescenttechnique)采用荧光素（异硫氰酸酯、罗丹明）标记。将荧光色素同抗原或抗体结合，然后使其与组织切片或细胞涂片标本中各个相对应的抗体或抗原结合，用荧光显微镜检查其定位的方法免疫荧光法有直接法和间接法（sa-ndwich法）。直接法依靠荧光抗体与抗原或荧光抗原同抗体的结合；与此相反，间接法首先使抗原（抗体）结合相对应的抗体（抗原），然后让那种抗体（抗原）与相对应的荧光抗原（抗体）结合。四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较：(A)明视野显微镜；(B)相差显微镜；(C)微分干涉显微镜；(D)暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制，在可见光下其分辨极限只有0.2μm，即使在紫外光下，最大分辨率也只有0.1μm，要观察更精细的结构，只有借助分辨率更高的电子显微镜。电子显微镜透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)Ruska1932年发明。以电子束为光源，波长比可见光和紫外光短得多，且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比。最大分辨率达0.2nm。1、透射电镜的结构由5部分组成：电子照明系统：电子枪；真空系统：用真空泵和油扩散泵获得高真空；电磁透镜成像系统：规范电子的行为；记录系统：用荧光屏观察影像，用照相系统记录影象；电源系统：提供高压稳压。PARTONE2、电镜制样技术SectionsofLM:5um;SectionsofTEM:100nm石蜡切片:3-10um;超薄切片:40-50nm（1）超微切片技术由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。PARTONEThinsections