大肠杆菌高效合成蒜糖醇的途径设计与改造研究.pdf

摘要

蒜糖醇是一种低热量的稀有糖醇，具有降低血糖水平和促进肠道蠕动的作用，

对健康有显著的益处。由于其具有独特的生理生化特性，作为一种功能性甜味剂和

重要的药物中间体，在食品、医药和化工等领域应用广泛。然而，自然界的蒜糖醇

含量稀少，其提取过程繁琐且受多重因素制约。因此，难以实现大规模的工业化生

产。基于微生物催化生物合成蒜糖醇的生产方式具有操作简便、环境友好和特异性

强的优势，有望成为实现蒜糖醇的规模化生产的高效手段。本研究通过在大肠杆菌

中引入蒜糖醇合成途径并结合代谢通路改造构建了蒜糖醇高效生物合成的工程菌株。

具体研究结果和内容如下：

（1）在大肠杆菌中共表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶（SfDAE）、核糖醇脱氢酶

（KpRD）和甲酸脱氢酶（FDH）构建了蒜糖醇的生物合成途径，菌株MGSKF全细

胞催化10g/LD-果糖产生蒜糖醇的初始产量为2.25g/L。随后，引入SecY(ΔP)通道

使D-果糖以非磷酸化形式进行蒜糖醇的合成，蒜糖醇的产量达到9.65g/L提高了3.3

倍。

（2）由于蒜糖醇的合成过程需要消耗NAD(H)，内源NAD(H)含量是影响其合

成效率的重要因素。为了解决内源NAD(H)含量不足对蒜糖醇高效生物合成的限制，

利用CRISPR-Cas9系统敲除编码NAD(H)分解代谢酶的基因nudE、mazG和ushA。

不添加外部NAD(H)菌株MGPSKF全细胞催化10g/LD-果糖仅积累了0.7g/L蒜糖醇，

而菌株MGPD3SKF积累了9.75g/L蒜糖醇，其产量增加了12.9倍。结果表明，菌株

MGPD3SKF胞内合成的NAD(H)可以满足蒜糖醇的生物合成。

3）进一步敲除了PTS系统果糖特异性转运蛋白元件（FruA）、甘露糖转运蛋

（

白元件（ManZ）、果糖激酶（Mak）和磷酸果糖激酶（FruK），以阻断D-果糖流向糖

酵解途径的代谢流，将碳通量定向至蒜糖醇合成途径。由此产生的菌株MGPD7SKF

发酵产生了18.07g/L蒜糖醇，产率为0.90g蒜糖醇/gD-果糖。

（4）分析M9培养基的成分对蒜糖醇产量的影响并优化了发酵工艺参数，在添

加15g/L甘油和2mL/L微量元素的改良M9培养基中菌株MGPD7SKF蒜糖醇的产

量达到19.5g/L。经分批补料发酵64h后，工程菌株MGPD7SKF生产D-蒜糖醇的滴

度达到320.8g/L且无中间产物残留，产率为0.98g/g，转化率为98.0%。研究结果表

明工程菌株MGPD7SKF具有大规模高效生物合成蒜糖醇的潜力，为蒜糖醇的大规模

生物合成提供了一种简便、高效的策略。

关键词：大肠杆菌；蒜糖醇；代谢工程；碳通量；微生物发酵

ABSTRACT

Allitolisalow-calorieraresugaralcoholwiththeeffectsofreducingbloodsugarlevels

andpromotingintestinalperistalsis,whichhassignificanthealthbenefits.Ithasgreat

applicationprospectsinthefieldsoffood,medicine,andchemicalengineeringasafunctional

sweetenerandimportantpharmaceuticalintermediatebecauseofitsuniquephysiologicaland

biochemicalcharacteristics.However,therearefewallitolsinnature,andtheirextraction

processiscomplexandconstrainedbymultiplefactors.Therefore,itisdifficulttoachieve

large-scaleindustrialproduction.Theproductionm