细胞生物学研究方法.ppt

第二节细胞及其组分的分析方法*12543超离心技术分离细胞组分细胞组分的细胞化学显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性定量细胞化学分析与细胞分选技术12345一超离心技术分离细胞组分*A是分离细胞器及各种大分子基本手段。B转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。C转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。D超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。01040203差速离心：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使样品中不同组分以不同速率沉降。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分等密度沉降用于分离不同密度的组分细胞组分的细胞化学显示方法DNA：福尔根（Feulgen）反应－－紫红色多糖类：PAS反应－－黄色脂肪：苏丹III－－红色蛋白质：米伦（Millon）－－红色细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂与所检测物质中的一些特殊基团特异性结合，显现出颜色来判断含量和分布的技术金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸。联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。显示方法三特异蛋白抗原的定位与定性*免疫荧光技术将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在细胞内的分布。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。直接免疫荧光标记技术：将荧光分子与抗体欧联后直接用于免疫标记技术间接免疫标记技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）。2免疫电镜技术*将样品进行特殊标记增强反差，从而进行亚细胞结构和分子的定位。特点:分辨率高根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。010302四细胞内特异核酸的定位与定性*细胞内特异核酸的定位与定性通常采用原位杂交技术原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。12A免疫胶体金标记技术原理示意图，细菌蛋白A可以与胶体金结合，也和与胶体的Fc端特异性结合B免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布特异性强容易识别分辨率高胶体金是直径1-100mμm的金颗粒分散在水中形成的金溶胶。特点：免疫胶体金技术：logo五定量细胞化学分析与细胞分选技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计用途：*STEP1STEP2STEP3STEP4对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。A流式细胞仪分选原理示意图B显示流式细胞仪分析处在不同相的HaLa细胞的实验结果logo第三节细胞培养与细胞工程细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要是利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、基因转移、细胞及组织培养等。目的是获得细胞产品或利用细胞本身。（一）动物细胞培养*原代细胞：1—10代以内的细胞原代细胞的培养：提取健康动物的组织块，剪碎用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与螯合剂等将细胞分散给予良好的营养液与无菌环境在培养中进行慢速转动或静止培养无论何种培养液都要加入一定量的小牛血清贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制（contactinhibition），也叫单层细胞培养。01细胞系：能够传代40-50次并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。