代谢工程改造酿酒酵母合成谷氨酸的研究.pdf

摘要

酵母抽提物富含氨基酸、多肽、B族维生素、呈味核苷酸及微量元素，具有纯天

然、味道醇厚、营养丰富等诸多优点，广泛应用于食品领域，但其鲜度不够突出（谷

氨酸含量不足）。酿酒酵母是我国酵母抽提物产品的主要生产原料，通过代谢工程与

合成生物学策略对酿酒酵母进行改造，可以提高酿酒酵母合成谷氨酸的能力。但是，

由于酿酒酵母相较于原核生物具有更复杂的氨基酸调控机制，强化以酿酒酵母为平台

的氨基酸代谢途径具有很大提升空间，所以通过代谢工程强化酿酒酵母内源氨基酸代

谢路径是合成氨基酸基化合物的重要前提。本课题以酿酒酵母AY12α为出发菌株，

以蔗糖为碳源，通过三酸酸循环（TCA）途径的修饰、谷氨酸合成途径的强化、跨膜

转运的强化及副产物的抑制等手段提高酿酒酵母利用蔗糖合成谷氨酸。主要研究内容

结果如下：

探究了增强三羧酸循环碳流量相关的6个关键基因对谷氨酸含量的影响（编码磷

酸烯醇丙酮酸羧激酶基因PCK1、丙酮酸羧化酶编码基因PYC2、丙酮酸脱氢酶编码基

因亚基PDA1、柠檬酸合酶基因CIT2、顺乌头酸酶基因ACO2、异柠檬酸脱氢酶基因

IDP1）。分别构建了过表达PCK1、PYC2、PDA1、CIT2、ACO2和IDP1基因的工程

菌株。与出发菌株相比，AY12α-CIT2和AY12α-ACO2菌株的谷氨酸含量分别提高了

34%和33%，其余菌株的谷氨酸含量都有降低。

探究了强化谷氨酸合成途径的相关基因对谷氨酸含量的影响。（涉及基因有谷氨

酸合酶编码基因GLT1、谷氨酸脱氢酶编码基因GDH1）。构建过表达GLT1、GDH1

基因的工程菌株，与出发菌株相比，重组菌株AY12α-GLT1和AY12α-GDH1谷氨酸

含量均有提高，分别提高了23%和20%。

探究了强化跨膜转运相关的3基因对谷氨酸含量的影响（编码α-酮戊二酸转运蛋

白编码基因ODC1、谷氨酸转运蛋白编码基因AGC1、葡萄糖跨膜转运蛋白编码基因

MTH1）。分别构建了过表达ODC1、AGC1和MTH1基因的工程菌株。与出发菌株相

比，AY12α-MTH1菌株的谷氨酸含量比原菌提高了40%，而其余两株均降低，仅为原

菌谷氨酸含量的89%和88%。

探究了抑制发酵副产物相关基因对谷氨酸含量的影响。（涉及基因有乙醇脱氢酶

编码基因ADH2、异柠檬酸裂解酶编码基因ICL1、α-酮戊二酸脱氢酶编码基因KDG1/2、

丙酮酸脱羧酶编码基因PDC1）分别构建过表达ADH2基因，敲除ICL1、KDG1/2和

PDC1基因的工程菌株。发酵结果显示出，与原菌AY12α相比，重组菌株AY12α-ADH2、

AY12α-∆ICL1和AY12α-∆KDG1谷氨酸含量分别提高了14%、24%和20%，而

AY12α-∆KDG2和AY12α-∆PDC1均降低。

在前面研究的基础上，对各基因进行组合优化，以过表达柠檬酸合酶基因CIT2

的AY12α-CIT2为出发菌株，过表达三羧酸循环、谷氨酸合成及乙醇利用的相关基因

ACO2、PDA1、ADH2、IDP1、GLT1和GDH1；以过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因

的AY12α-PCK1（丢KanMX抗性）为出发菌株，过表达CIT2构建双基因过表达菌株。

谷氨酸产量提高最多的是AY12α-PCK1+CIT2菌株，相比亲本菌株其产量提高了2.99

倍。

以上述AY12α-PCK1、AY12α-ADH2、AY12α-CIT2、AY12α-GLT1和AY12α-PCK1

+CIT2为出发菌株，分别敲除副产物ICL1、KDG1基因构建组合敲除过表达菌株，发

酵结果显示出，与原菌AY12α相比，组合敲除过表达菌株AY12α-CIT2-∆ICL1、

AY12α-PCK1+CIT2-∆ICL1和AY12α-PCK1+CIT2-∆KDG1三个菌株的谷氨酸含量均有

较高的提升，分别为原菌的2.86、3.28和3.74倍；菌株AY12α-CIT2-∆KDG1、

AY12α-GLT1-∆KDG1的谷氨酸产量也分别提高了1.38和1.53倍。

为进一步提高谷氨酸的含量，以AY12α-PCK1+CIT2为出发菌株，过表达AGC1、

GLT1、ACO2、PDA1、ODC1、IDP1、ADH2和GDH1基因，构建