细胞形态学检查.pptVIP

：①如果小于23号针头则回收内皮细胞效果差，若针头过大则注射器内压大会吸入紧贴内皮细胞的平滑肌细胞，因此注意使用恰当的针头；②人血管内皮细胞对营养条件要求高，是依赖于生长因子的一种细胞。常用的培养基为RPMI1640，培养时添加15%FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改进的培养基有MCDB109培养基，市场上也有内皮细胞商品培养基，可根据需要选择购买；③培养基中必须加入相应抗生素，最终浓度：庆大霉素为15μg/ml，氨苄青霉素为50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四环素1μg/ml。在48h内可以防止细胞感染，3日后还应添加庆大毒素。注意事项脐带静脉内皮细胞培养在婴儿出生时立即将脐带放置于无菌的500ml磷酸盐溶液（PBS）中低温保存。次日分离细胞。脐带有一根静脉两根动脉，通常用内腔大静脉。将洗净的静脉一端用夹子夹紧，一端注入消化液，静置孵育片刻。然后PBS或培养液反复抽吸内腔，收集后与消化液一并离心、沉淀内皮细胞。所用培养基与大动脉内皮细胞培养基相同，脐带静脉内皮细胞、大动脉内皮细胞易于培养，既使不加生长因子在最初几代细胞也会增殖良好。血管内皮细胞重要标志第Ⅷ因子关连抗原（vonwillebrandfactor,VWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应抗体。VWF有其特异性，人的VWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。兔疫荧光间接法测定该因子，阳性细胞出现细长的荧光颗粒，在核周围的颗粒较密，细胞边缘颗粒较少。Weibel-Palade小体，该小体是血管内皮细胞又一特异性的标志。电子显微镜下，呈现0.1～0.3μm,长0.5～5μm的椭圆形棒状结构。上述的VWF就是该小体产生的。血管平滑肌细胞的培养血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法（explant）和酶解离法（enzymedisperse）。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。培养平滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。1．贴块法方法：动物经颈动脉放血后，在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段，置于含Hanks液的平皿中漂洗3次，将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，然后纵行切开血管，刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，浸泡在含血清的Hanks液中，并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37℃恒温箱，2h左右，取出培养瓶加入20%胎牛血清的培养液，再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。培养时注意事项为了保证培养的成功，应注意：①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%～20%；③培养基的选择：常用的有DMEM（DulbeccosmodifiedEaglesmedium），M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。2．酶解离法沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%～10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养，对于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺（0.2g/L）较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。动脉平滑肌的特性由于贴块法和解离法处理方式不同，在细胞培养的最初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长，培养环境趋于一致，细胞特性上也趋于近似。光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需6～7天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。牙髓细胞的培养培养用液：PBSA；胶原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml；培养液：DMEM＋10％FBS；Protocol：取拔除的正畸牙或阻生牙（年龄小者较佳），尽量完整的取出牙髓，置于培养皿中，用PBS冲洗；将牙髓放入离心管，加入胶原酶2－3ml/牙，37℃，2－3小时（原则是将牙髓消化彻底）；加入等量培养液，吹打至单细胞，离心，重悬，接种，牙/6well；单击此处可添加副标题牙周细胞的培养培养用液：PBSA；胶原酶：I型，用D－