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凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验--第1页
凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的
实验
作者：王盛兰王熙才伍治平金从国陈晓群蒋
永新谷玉兰陈艳周永春腾毅山【摘要】目的探讨凝血酶对非小细胞肺癌
细胞株A549分泌血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,
VEGF）的促进作用及其机制。方法采用ELISA法检测凝血酶对A549细胞分泌
VEGF的浓度以及水蛭素对其阻断作用。采用RT??PCR法检测凝血酶受体PAR??1
在A549细胞中的表达。结果凝血酶在0.5～3U/ml的浓度范围内可以明显地增
加VEGF的分泌，而＜0.5U/ml时这种促进作用则不明显，水蛭素能够完全阻断
凝血酶的这种促进作用。PAR??1在A549细胞中表达，而在正常的胎肺细胞
（KMB??17）中并不表达。结论在一定浓度范围内，凝血酶能有效地促进A549
细胞VEGF的分泌，而这种促进作用可能与PAR??1受体的表达有关。【关键
词】凝血酶；水蛭素；非小细胞肺癌；血管内皮生长因子1
与方法1.1主要材料Trizol试剂，购自天为时代生物有限公司；
RT??PCR试剂盒、PCR试剂盒，由MBI公司生产；凝血酶冻干粉、重组水蛭素冻
干粉，由SIGMA公司生产；人VEGFELISA试剂盒，购自深圳晶美生物有限公
司；RPMI1640培养基，购自GIBCO公司；新生小牛血清，购自中国医学科学生
物工程研究所。1.2方法1.2.1细胞培养A549细胞于
RPMI1640培养基+10%小牛血清,对数生长期收集细胞,调整细胞浓度为
2×105/ml,KMB??17细胞于DMEM培养基+10%小牛血清培
养。1.2.2ELISA方法检测VEGF的分泌（1）标本收集肺非小细胞肺癌
患者血清138份（包括腺癌57例、鳞癌68例、大细胞癌13例），保存于-
20℃冰箱。（2）细胞培养上清液的收集①将A549细胞稀释到上述浓度，接
种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换细胞培养液同步24h。实验分组
（每组8孔）：凝血酶0.5U/ml组、凝血酶1.0U/ml组、凝血酶3.0U/ml组、
以1640培养液为空白对照，收集细胞培养上清液保存于-20℃。②将A549细
胞稀释到上述浓度，接种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换培养液。
实验分组（每组8孔）：凝血酶3.0U/ml细胞、凝血酶3.0U/ml细胞+3.0U/ml
水蛭素、以1640培养液为空白对照，分别在6、16、24h收集细胞培养上清液
保存于-20℃。(3)VEGF的测定按照人VEGFELISA试剂盒说明进行测定,在实
验中标准品和样本均双复孔检测。1.3逆转录聚合酶链式反
应1.3.1细胞A549、KMB??17总mRNA的提取(1)直接在贴壁生长细胞
的培养瓶中加入Trizol（1ml/10cm2），用尖吸管反复吹打几次后，将裂解液
移入EP管中，加入1/5Trizol体积的氯仿，充分震荡，4℃
12000g×5min；(2)吸上层水相移入新管，加1/2体积的异丙醇，4℃
12000g×10min去上清，沉淀用75%乙醇洗涤，-20℃放置20min,4℃
12000g×15min；(3)去上清，室温干燥，4
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