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基本原理SDS碱裂解结构差别分子量差别变性－复性一、质粒DNA的提取流程碱裂解Ⅱ碱变性接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mLLB羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中?370C，190rpm振荡培养过夜?4000rpm、离心1min，收集所有菌体?150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min?加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清接菌培养收菌碱裂解Ⅰ?加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性?12000rpm，离心10min?上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）?12000rpm，离心5min?上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）?12000rpm，离心5min?复性回收纯化上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温30min?12000rpm，离心10min?沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）?12000rpm，离心5min?沉淀于超净台中风干（5min～20min）?沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解?-200C保存醇沉回收溶解保存离心标识碱裂解Ⅰ溶液Ⅰ冰浴pH8.0剧烈振荡10min溶液粘稠混浊碱裂解Ⅱ！！溶液Ⅱ现用现配切勿振荡！颠倒混匀T≤5minSDS包被复性回收！！溶液Ⅲ冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀15min仅质粒复性？在哪相？二、质粒DNA的电泳制胶：1%琼脂糖（20mL，1xTAE)缓冲液：1xTAE，130mL制样：质粒DNA2μL
10xloading0.5μLMarker：5μL电泳：80伏恒压结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量QA关于PCR结果分析
关于产物回收
①漂洗作用：换缓冲液，除杂
②乙醇：保存目的产物
③离心：去乙醇，除液体，保证后续工作④补救：勿轻易弃置；
高盐结合，重复漂洗。
关于…………123456M789101112Fig.1AgaroseElectrophoresisanalysisofthePCRproducts.Lane1～Lane12：productsofPCR
M：DNAmarker（fromtoptobottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）引物或其二聚体问题：①10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？回收，重新电泳鉴定。②1、12泳道：未加引物或模板。相邻泳道溢出污染非特异性！Good！！PCR仪中的
位置边缘效应？！胶融！胶融！外溢质粒DNA的提取
及其定性定量分析基因的克隆与表达专题之二主要内容一、质粒DNA提取二、琼脂糖电泳鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测
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